弓形虫MAG和tSAG1在转基因番茄中的表达研究

发布时间：2020-07-23 17:30

【摘要】：植物口服疫苗，成本低廉，使用简便，可规模化生产，且具有完整的真核细胞表达系统；果蔬类植物如番茄、香蕉等以其独具的可食(饲)性在疫苗研制方面展示了良好的开发应用潜能。目前已有多种疫苗分子在转基因植株中得到表达，部分植物疫苗经动物实验和志愿者的口服免疫测试结果表明：其可有效激发机体产生特异性的局部粘膜免疫反应和全身体液免疫、细胞免疫反应。 弓形虫：呈世界性分布，宿主广泛，人群感染率高，危害严重，尤其对孕妇、儿童和免疫力低下人群以及畜牧业生产均构成严重威胁。因此，弓形虫感染与弓形虫病最好的防治手段是能研制出价廉易用的疫苗。植物基因工程的发展给弓形虫疫苗研制带来新的思路。 本研究利用自行克隆鉴定的番茄果实特异性E8启动子，以及植物组成型启动子E35S，驱动优势弓形虫疫苗候选分子MAG和tSAG1，转化番茄，筛选鉴定获得转基因番茄植株，并进行转化植株T1代初步的遗传分析，期望获得值得进一步深入研究的能高效稳定表达MAG和tSAG1的番茄转化株系，为研制弓形虫转基因番茄口服疫苗，探索弓形虫感染和弓形虫病的有效防治途径，奠定工作基础。 Ⅰ．番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析 目的 获取番茄果实特异性E8启动子基因，为实现外源基因在转基因番茄中果实特异性表达做准备。 方法 培养中蔬5号(Zhongshu No.5)番茄幼苗，采集叶片，用Omega公司的植物基因组提取试剂盒提取番茄基因组DNA；设计引物，从基因组中通过PCR扩增获得番茄果实特异性E81.1(E8核心启动子区)和E82.2(E8启动子全长)基因；克隆进pGEM-T载体，酶切鉴定；送上海基康公司测序；序列分析。 第一军医大学薄士学应论戈 摘要 结果 从番茄基因组DNA中PCR扩增得到预期大小的启动子片段;构建重 组pGEM一T一E81 .1和pGEM一T一E82.2载体，经酶切证实具有预期大小的插 入子片段;测序结果分析显示:番茄果实特异性E8启动子序列高度保守， 所获得的Zhongshu No.5 E82.2启动子DNA序列与Deikman J.报道的 eherry种的E82.2启动子同源性为99%，登陆GENBANK，ID号为 AFS 1 5784。 结论 成功获得我国优良纯种番茄zhongshu No.5果实特异性E81.1、E82.2 启动子基因，这是我国番茄果实特异性E8启动子序列的首次报道。 n.弓形虫MAG植物表达载体的构建 目的 将含弓形虫多个保护性抗原表位的编码基因即多表位基因(MAG)， 分别用植物组成型启动子E35S和番茄果实特异性E82.2启动子以及 E35S一E81.1复合式双启动子驱动，构建MAG植物表达载体。 方法 1将MAG亚克隆进PBAC55载体，构建中间载体pB35MG，其以含双增 强子的花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子(E35S)驱动MAG，3’端携带胭脂 碱合成酶基因终止子(NOS3’)序列，组成E35S/MAG/NOS3’结构单元，经 酶切和测序证实后，再将其中E35S/MAG/N 053，结构单元亚克隆进 pCAMBIA2300质粒中，构建植物表达载体pC35MG。 2用酶切法将番茄果实特异性启动子E81 .1插入pB35MG载体中，构 建含E35S一E81.1复合式双启动子驱动MAG的中间载体pB35EIMG，再将 其中E35SE81.l/MAG/NOS3’结构单元亚克隆进pCAMBIA23OO质粒中，构建 植物表达载体pC35EIMG。 3用酶切法将番茄果实特异性启动子E82.2插入pB35MG载体，构建 以E82.2启动子驱动MAG的中I’ed载体pBEZMG，再将其中E82.2/MAG/NOS3， 结构单元亚克隆进pCAMBIA2300质粒中，构建植物表达载体pCEZMG。 男‘荤诬比拿厚士学游论戈 荷要 4植物表达载体PC35EIMG、pCEZMG中的目的基因MAG序列经测序进 行鉴定。 5含三种启动子驱动MAG的植物表达载体转化根癌农杆菌乙石火4404 感受态细胞后，提取农杆菌质粒进行酶切及PCR鉴定。 结果 重组质粒用酶切和PCR鉴定均得到预期大小片段，琳G中间载体 pB35MG及植物表达载体pC35EIMG、pCEZMG均经序列测定确证。 结论 成功构建MAG中间载体pB35MG、pB35EIMG、pBEZMG，以及植物表达 载体pC35MG、pC35EIMG、pCEZMG，并将三种植物表达载体成功导入根癌 农杆菌乙石翅4404。 m.弓形虫tsAGI植物表达载体的构建 目的 将优势弓形虫疫苗分子SAGI基因截短片段(tSAGI)，分别用植物组 成型启动子E35S和番茄果实特异性E82.2启动子以及E35S一E81.1复合 式双启动子驱动，构建tSAGI植物表达载体。 方法 1自本室构建的pET32a一tSAGI载体中PCR扩增得到tSAGI基因，克 隆进T载体为pMD一T一tSAGI，酶切鉴定后进行测序确认。 2用BamHI单酶切连接方式将tSAGI分别亚克隆进pB35MG、 pB35EIMG、 pBEZMG载体，分别构建中间载体pB35tSAGI、pB35EltSAGI、 pBEZtSAGI载体。其中，pB35tSAGI以E35S驱动tSAGI，3，端携带NOS3， 终止子序列，组成E35S八SAGI/NOS3’操纵子结构单元。pB35EltSAGI含 E35S一E81.1复合式双启动子驱动tSAGI，组成E35SE81.l八SAGI/NOS3， 操纵子结构单元。PBEZtSAGI以番茄果实特异性启动子E82.2驱动tSAGI， 组成E82.2八SAGI/NOS3，操纵子结构单元。 3 pB35tSAGI、pB35EltSAGI、pBEZtSAGI经酶切证实后，分别将其 中E35S八SAGI/NOS3，、E35S一Esl.1八SAGI/NOS3，、E82
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346
【图文】：

取的番茄基因组DNA，呈单一条带，纯度高，植物基因组提取试剂盒，提见图2.1。二、PCR结果以番茄基因组DNA为模板，P1、P2扩增得到预期大小的约1.Ikb片段，P3、P2扩增得到预期大小约2.Zkb片段。见图2.1、图2.2。三、印1.1一poEM一T和E82.2一pG〔M一T重组质粒的鉴定E81.1一PGEM一T重组质粒经xbal单酶切后，切出预期1.Ikb片段;ES1.1一pGEM一T和E82.2一pGEM一T重组质粒用Hindlll/BamHI双酶切后，分别切出了预期1.Ikb和2.Zkb片段;说明E81.l和E82.2果实特异性启动子己正确插入PGEM一T载体中。见图2.3、图2.4。

茄果实特异性E81.1启动子基因重组A标准分子量2pGEM一T空载体ApCR产物纯化片段4pGEM一T-E81，Ib5，6:pGEM一不Esl.lHindlll+B田旧Hl双tifieationoftherecombinantPlas而deoh”it·sPeeifieE81，1PromotergenLanelnNAmarkerLaneZPGEM~T从p3PurifiedPCRProduetofEsl.lPromoterT-E81.1尤Kba1Lanes，6PGEM一T-E812345

一、重组质粒pMD一T一tSAGI的鉴定以引物Pl、PZ自pET32a一tSAGI扩增获得预期700bp的弓形虫tSAGI基因(图3.14)。纯化后的tSAGI基因克隆进pMD一T载体后，用BamHI单酶切鉴定重组质粒，可切出700bp的目的片段(图3.14);将此重组质粒送公司进行序列测定证实序列完全正确。123从图3.14重组质粒pMDesT一tSAGI的酶切鉴定图质粒pMD一TBaJ刀Hl酶切重组质粒BalnHI酶切纯化的tSAGIPCR产物分子量标志物Fig.3.14IdentincationofrecombinantPlas而dpMD一T-tSAGIbyenzymedigestionLane1PMD一TdigestedwithBalllH1Lane2PurifledtSAGIPCRP代心uetLane3ReeombinantPlas而ddigestedwithBalnH1Lane4DNAmarker二、tSAGI中间载体pB35tSAGI、pB35EltSAGI、曲EZtSAGI的鉴定pB35tSAGI、pB35EltSAGI、pBEZtSAGz用BalnHI酶切均可切出预期大小700bp插入子片段。pB35tSAGI用Xbal单酶切，若正向插入预期仅切出一线性化大片段，若反向插入则可切出700bP片段;pB35EltsAGI用Xbal单酶切，若正向插入预期可切出1100bp，反向插入可切出1800bP7l

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

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本文编号：2767622