粘着斑激酶对β1，4-半乳糖基转移酶Ⅰ的表达和活性调控

发布时间：2020-07-27 15:45

【摘要】： 粘着斑激酶对β1，4—半乳糖基转移酶Ⅰ的表达和活性调控 β1，4—半乳糖基转移酶Ⅰ(Galt)在生物体内负责参与复合糖形成和细胞间的相互作用。GalT在层粘连蛋白上伪足形成和细胞迁移与粘着斑激酶(FAK)瞬时酪氨酸磷酸化，肌动蛋白细胞骨架和粘着斑重组有关。FAK和Galt都定位在粘着斑，都与细胞骨架相互作用。FAK在整联蛋白介导的细胞粘附到细胞外基质的信号调节中起重要作用。激活FAK引起许多生物学功能象细胞粘附，迁移，细胞生存，凋亡，细胞周期调节和增殖。 细胞表面的GalT可以作为层粘连蛋白的受体参与由层粘连蛋白引起的多种生物学行为，包括：促进细胞粘附、转移、分化、轴突的生长、精卵识别、肿瘤转移等。G1／S调控点调节蛋白质p16控制GalT mRNA转录、表面和总GalT活性。然而，FAK对Galt的作用尚不清楚。所以我们将野生型FAK(wtFAK)和不同的FAK突变体转染到NIH3T3细胞系，用Northern blot杂交方法检测GalT基因表达，测量它的活性。结果发现wtFAK和FAKY576F上调GalT基因表达和表面酶活性，而FAK的dominant negatiVe突变体FAKY397F下调Galt基因表达和表面酶活性。同时，我们采用ricinus communis agglutinin(RCA)-Ⅰ凝集素染色的方法反映GalT的产物变化。我们发现与对照细胞相比，转染wtFAK和FAKY576F增加细胞表面半乳糖基，而转染FAKY397F减少细胞表面半乳糖基。流式细胞仪分析显示发现与转染pcDNA3的NIH3T3细胞相比，wtFAK和FAKY576F促进G1／S期转换，而FAKY397F抑制G1／S期转换。G1／S调控点调节蛋白质控制GalT mRNA的转录。WtFAK和FAKY576F提高cyclin D1，减少p16的表达，而FAKY397F降低cyclin D1，增加p16的表达。WtFAK减少cyclin D3，p21的表达，而FAKY397F和FAKY576F增加cyclin D3，p21的表达。本实验室报道细胞周期抑制基因p16转染A549细胞，引起细胞G1期阻滞，导致Galt基因表达和活性受到抑制。而本实验发现wtFAK增加细胞表面GalT活性，对总的细胞GalT活性没有明显变化。从这些结果推测有更多的细胞周期因子参与FAK对Galt的表达和活性的调控。这些结果也暗示细胞周期特定的蛋白质调节G1／S期转换，诸如Rb-E2F复合物和E2F-DP复合物可能参与GalT mRNA的转录调节。已有实验阐明cyclin D1而不是p21在FAK对细胞周期的影响中起重要作用。本实验进一步发现反义cyclin D1能抑制Galt mRNA的表达。细胞共转染Galt promoter／luciferase reporter和反义cyclin D1，发现虫荧光素酶报告基因活性明显下降，表明反义cyclin D1抑制Galt mRNA的表达可能通过抑制GalT的转录。这些结果表明NIH3T3细胞中， FAK调节Ga1T的表达和活性可能与FAK对细胞周期的影响有关。 高度转移的细胞表面Ga1T表达升高与它们在体外的侵袭特性和体内的转移 表型有关。上述研究表明NIH3T3细胞中，FAK调节GalT的表达和活性与其对细 胞周期的影响有关。Y397是FAK自磷酸化的主要位点，能够结合Src，PI3K和 其它信号蛋白的SHZ domain。Dominant negative FAK突变体抑制细胞周期的进 展需要Y397，这表明Src和/或磷脂酞肌醇3激酶(P工3K)参与FAK调节细胞周 期这个过程。FAK/Src相互结合，随后激活Erk信号通路，与整联蛋白调节的细 胞周期进程有一定的关系。此外，FAKY397也结合P工3K，PI3K能够调节细胞周 期发展和增殖。这个结果提高了FAK可能通过结合SrC和/或P工3K影响Ga1T mRNA 表达的可能性。因此我们进一步观察在SMMC一7721细胞，FAK和它的相互作用分 子对Ga1T表达的影响。 不同的FAK和SrC质粒瞬时转染SMMC一7721细胞。发现与pcDNA3.l转染的细胞 相比，wtFAK增加Ga1T mRNA的表达，而dooinant negative突变体FAKY397F减少 Ga1T mRNA的表达。RCA一1 lectin blot研究表明，与对照细胞相比，wtFAK转染 的SMMC一7721细胞膜蛋白中半乳糖基化明显升高，而FAKY397F转染的细胞膜蛋白 中半乳糖基化明显降低。 FAK过表达增加FAK的酪氨酸磷酸化，而FAKY397F过表达 减少FAK的酪氨酸磷酸化。WoI’tmannin是P工3K的特异的，有力的抑制剂，它能够 抑制Ga1T的转录水平，而wtFAK能够逆转由wortmannin对Ga1T的转录水平的抑制。 这表明除了PI3K，可能还有其它信号分子同时影响Ga1T的转录水平的改变。进一 步，我们发现与转染pKH3空载体的SMMC一7721细胞相比，pKH3一esreY527F，编码 持续激活的Src蛋白，转染SMMC一7721细胞增加Ga1T的基因表达，而转染 pKH3一csreK295M，编码一种dominant negative Sre蛋白，抑制Ga1T的基因表达。 此外，共转染1.skb Ga1T promoter/lueiferase reporter和wtFAK或持续激活的 Src虫荧光素酶报告基因的活性增加，而dominant negative FAK和 constitutively inaetive Sre与Ga1T promoter/lueiferase reporter共转染， 下调虫荧光素酶报告基因的活性。这些结果表明SMMC一7721细胞中，FAK激活P工3K 同时激活Src，而促进Ga1T的基因表达可能通过促进GalT转录。肝癌细胞FAK诱导 Ga1T高表达，同时增加细胞膜蛋白半乳糖基化。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：Q55

【共引文献】

相关期刊论文 前4条

1 张洁;刘洋;杨红旺;许海燕;孟雁;;高糖条件下p58促胰岛β细胞凋亡的机制[J];生理学报;2009年04期

2 马汝海;王冬青;潘忠诚;王天骄;何群;赵雨杰;;小鼠肝癌及肝正常组织B4GalT糖基转移酶家族mRNA表达差异及其对细胞膜相关糖链的影响[J];生命科学研究;2012年01期

3 余诗灏;孟雁;;CDK11~(P58)调节细胞增殖与凋亡机制[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年08期

4 王猛;张刚;;CDC2L1~2基因及与肿瘤的关系[J];医学综述;2014年12期

相关博士学位论文 前2条

1 宗鸿亮;CDK11相关蛋白及cyclin D3/CDK11调控雄激素受体转录活性的研究[D];复旦大学;2006年

2 李义;中国人群2型糖尿病易感基因CDC2L2的筛选及其参与胰岛β细胞凋亡途径的研究[D];中国协和医科大学;2006年

相关硕士学位论文 前5条

1 何兴新;CDK11~(p58)在施万细胞炎症应激中的表达及其意义的研究[D];南通大学;2010年

2 刘洋;过表达CDK11p58基因通过影响细胞周期导致β细胞凋亡[D];中国协和医科大学;2009年

3 张洁;p58促胰岛β细胞凋亡机制的研究[D];中国协和医科大学;2008年

4 余诗灏;CDK11~（p58）促进人胰腺导管腺癌细胞增殖机制的研究[D];中国协和医科大学;2010年

5 何兴新;CDK11~(p58)在施万细胞炎症应激中的表达及其意义的研究[D];南通大学;2010年

本文编号：2772040