胰岛素淀粉样纤维形成、抑制和解构研究

发布时间：2020-08-06 12:17

【摘要】： 病理学研究表明,至少20种淀粉样蛋白与神经变性疾病、糖尿病等顽疾密切相关,如阿尔茨海默氏病、II型糖尿病、帕金森综合症以及亨廷顿舞蹈症等。此外,因蛋白质变性而形成的聚集体,将给蛋白质药物的生产、贮藏与运输带来极大困难,同时对蛋白质药物的安全使用带来风险,是生物医药领域中亟待解决的技术问题。本文以模式药物蛋白胰岛素为研究对象,结合现代生物物理检测手段,对胰岛素聚集机理进行验证,建立新型淀粉样纤维体表征检测技术,提出氨水-过氧化氢两步法途径聚集淀粉样纤维和再生胰岛素二硫键,并开展了胰岛素低聚体和淀粉样纤维的相关抑制工作。具体研究内容和结论如下: 第一,综合利用圆二色谱、荧光光谱、动态光散射、电子显微镜和太赫兹时域光谱多种现代检测技术,多尺度表征胰岛素淀粉样纤维化过程中二级、三级、四级结构的转变与状态密度的改变,验证了胰岛素聚集机理;首次利用太赫兹时域光谱仪研究和检测蛋白质淀粉样纤维化行为,获得0.2 THz~2.0 THz频率区的太赫兹吸收谱和折光系数变化曲线,建立了一种利用太赫兹时域光谱技术对淀粉样蛋白质进行快速、无损的检测方法。第二,尝试使用NH_3-H_2O_2两步法对胰岛素淀粉样纤维进行解聚与单体二硫键断裂和恢复,并对比NH_3-H_2O_2耦合法,确定了还原-氧化过程的关键因素;提出氨水对胰岛素淀粉样纤维解聚的机理模型,指出氨水作用机制为通过改变蛋白周围亲疏水环境以及破坏固有氢键作用,逐步释放单个胰岛素分子。第三,对比不同类型多羟基化合物对胰岛素聚集与淀粉样纤维化过程的影响,分别解释了原花青素、白藜芦醇和海藻糖加入20% HAc溶液和20% HAc-0.1 M NaCl溶液体系后,胰岛素聚集荧光动力学和原纤/纤维的结构形貌改变;指出抑制能力顺序:原花青素白藜芦醇海藻糖,分别起到抑制成核、阻碍生长和无明显抑制的作用。第四,采用532 nm波长的激光,通过抑制胰岛素成核机理,阻碍成熟纤维形成;特别指出在使用动态光散射仪和ThT荧光光谱仪对样品进行在线测量时,应注意所测样品是否易于发生光化学反应,如发生聚集和解聚。本实验亦证明了连续激光照射将为胰岛素提供一个相对稳定的溶液环境,有利于维持胰岛素低聚体状态,关于自由基作用机理方面具有一定的研究前景。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341
【图文】：

示意图,示意图,相互作用,蛋白质

大时具有结构和构象稳定性。一旦环境发生改变，蛋白质将过调整侧链残基相互作用到达另一个稳定状态。其中，疏水核重要的作用，同时静电作用(盐键)、二硫键形成和发生在酪氨的偶极离子相互作用都会影响蛋白质折叠过程和结构稳定性。子间相互作用酸顺序决定蛋白质的三维结构，而结构又决定其生理功能。因象的作用力主要是蛋白质主链上氨基酸残基之间的相互作用，液环境的作用。它是由一些弱相互作用或称非共价键组成，包、范德华力和静电作用(示于图 1-2)。此外，二硫键和芳香作象方面也起着重要作用，蛋白质三级和四级结构的形成就来源作用力。

蛋白质,单体,稳定性,压力

tural-AZ[65])，对低聚体抑制剂的开发显然更具有研究意义。因认为是当前抑制蛋白质聚集和治疗淀粉样疾病方法中最具前制剂。它物理方法分解淀粉样纤维 1914 年诺贝尔奖获得者 P. W. Bridgman 发现高压导致蛋白去后，大量研究结果表明静水压能够破坏稳定蛋白自然状态的非随着蛋白质水溶液体系体积减小和蛋白质不断去折叠的过程，白质聚集体的体外解聚并重新折叠成为可溶性蛋白[66-68]。为了维稳定性和聚集热力学，研究者对静水压改变和温度扰动进究结果见图 1-4，说明了低温高水压对蛋白质聚集体解聚的热了稳定蛋白质有效途径。

粒径分布,胰岛素,纤维,水力学半径

时间为 21 h、46 h、56 h、71 h 和 73 h 的粒径分布。反应开始胰岛素在 20%乙酸中以主要以单体存在；反应 21 h 后，溶液中同时存在两种尺寸分布的颗粒——单体/低聚体(水力学半径为 1.8 nm/5.6 nm±0.1 nm)和胰岛素原纤(水力学半径为177.8 nm ±0.1 nm)；从 21 h~56 h，胰岛素粒径分布无明显变化，此时处于成核后期和聚集伸长期，逐渐形成胰岛素成熟纤维(粒径>1000 nm，由上千个胰岛素单体组成)，从而低聚体和胰岛素原纤的光散射强度均略微减小；聚集时间为 71 h时，溶液中出现大量胰岛素低聚体(水力学半径为 5.6 nm)，而达到 73 h 时迅速减少，形成胰岛成熟纤维，这一转变与圆二色结果一致。根据 DLS 数据，可知聚集 21 h，胰岛素以单体(1.8 nm)、低聚体(5.6 nm)和原纤(177.8 nm)状态存在。Stefan 等发现在 60oC 下 HCl 溶液中，胰岛素纤维化过程滞后期为~30 h，并且胰岛素初始粒径大约为 3 nm，对应于胰岛素二聚体，生长期不断出现粒径为 250 nm 的胰岛素原纤[81]。不同的溶液环境决定了蛋白质初始结构和低聚状态，随着聚集时间的增加，将会获得不同尺寸的粒径分布。因此，胰岛素纤维化过程受溶液环境影响。

【共引文献】