HTLV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞HMGB1基因转录调控机制的研究

发布时间：2020-08-22 05:00

【摘要】：第一部分不同T淋巴细胞中人HMGB1mRNA和蛋白的表达水平目的：观察HTLV-1+、Tax+和Tax-T淋巴细胞人HMGB1mRNA和蛋白的表达水平，分析Tax蛋白是否影响HMGB1的表达。方法：从Tax-T细胞（Jurkat和TaxN）、Tax+T细胞（TaxP）、HTLV-1+T细胞（MT-4、MT-2）提取总RNA和蛋白质，以及瞬时转染pCMV-Tax表达载体及其突变型Tax M22、Tax M47至Jurkat细胞，24h后提取总RNA和蛋白质。然后通过逆转录实时PCR定量检测HMGB1mRNA表达水平，分析Tax蛋白对HMGB1mRNA表达的影响；通过免疫印迹检测HMGB1蛋白表达水平，分析Tax及其突变蛋白对HMGB1蛋白表达的影响。结果：Tax+T细胞（TaxP）中HMGB1mRNA和蛋白质表达水平明显高于Tax-T细胞（Jurkat、TaxN）。HTLV-1+T细胞（MT-2、MT-4）中的HMGB1mRNA表达水平略微低于HTLV-1-T细胞（TaxP、Jurkat），而HTLV-1-T细胞（Jurkat）和HTLV-1+T细胞（MT-2、MT-4）间HMGB1蛋白未表现出明显的差异。瞬时转染Tax及其突变型M22和M47至Jurkat细胞中，Tax及其M22、M47突变蛋白促进HMGB1mRNA和蛋白的表达。结论：HTLV-1病毒Tax蛋白可能与某种转录因子相互作用促进人HMGB1基因的表达，而HTLV-1病毒的其他蛋白可能抑制HMGB1基因表达。了解不同T淋巴细胞中HMGB1基因表达情况，为进一步研究Tax蛋白如何影响人HMGB1基因调控奠定了基础。第二部分不同HMGB1荧光素酶报告基因及其Jurkat稳定细胞株的构建目的：构建不同高迁移率族蛋白B1（HMGB1）调控序列的荧光素酶报告基因及其稳定表达的Jurkat细胞株，为研究Tax蛋白影响HMGB1的转录调控提供质粒及细胞来源。方法：设计多个3’-端固定的HMGB1调控引物，以Jurkat细胞基因组DNA为模板，PCR扩增不同长度HMGB1调控基因（-83~+83、-383~+83、-688~+83、-975~+83、-1163~+83、-1327~+83、-1520~+83），均将其连入pMD18-T载体，并转化宿主菌DH5a，氨苄青霉素筛选，阳性克隆并提取质粒，经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序验证，正确的阳性克隆经KpnⅠ/HindⅢ双酶切后，连入pGL3-neo-luc报告基因的KpnⅠ/HindⅢ位点之间，成功构建含不同HMGB1调控基因的荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-luc质粒。同样，-1520~+83HMGB1调控基因经XhoⅠ/HindⅢ双酶切后，连入pGL3-neo-luc报告基因的XhoⅠ/HindⅢ位点之间，又构建出含-504~+83HMGB1的pGL3-HMGB1-luc质粒。转染不同pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc报告基因质粒至Jurkat细胞，48h后加入终浓度600μg/ml的G418进行药物加压筛选20d，然后选取单个阳性克隆细胞，用300μg/ml继续筛选2～3个月，荧光素酶活性验证是否成功构建其稳定表达的Jurkat细胞株。结果：以Jurkat细胞基因组为模板，克隆扩增7个3’-端固定的HMGB1调控基因，成功构建了8种pGL3-HMGB1-luc报告基因，按HMGB1基因由短至长顺序依次命名为pHLuc1～pHLuc8。转染pHLuc1～pHLuc8报告基因和pGL3-neo-luc至Jurkat细胞，经G418药物筛选，成功构建含有pHLuc1～pHLuc8或pGL3-neo-luc报告基因的Jurkat稳定细胞株，并根据HMGB1调控基因有无及其由短至长顺序，依次命名为HJ1～HJ8细胞和NEO细胞。结论：成功构建HMGB1荧光素酶报告基因及其HJ稳定细胞株，为找寻HMGB1启动子区域，研究Tax蛋白影响HMGB1基因的调控机制和HMGB1在成人T淋巴细胞白血病中的发病机制奠定基础。第三部分HTLV-1病毒Tax蛋白对人T淋巴细胞HMGB1基因转录调控的影响目的：观察不同T淋巴细胞中人HMGB1基因启动子活性，探讨Tax及其M22、M47突变蛋白对HMGB1基因转录调控的影响。方法：不同pGL3-HMGB1-luc报告基因和pGL3-neo-luc（对照）同时瞬时转染到THP1、Hela、Jurkat、TaxP、TaxN、MT-4、MT-2等不同种类细胞中，以及不同pGL3-HMGB1-luc报告基因与pCMV-Tax或其突变型M22、M47（pCMV-Neo作为对照）瞬时共转染到Jurkat细胞中，24h后检测荧光素酶活性，观察不同细胞中相对荧光素酶活性比率（HMGB1/neo）和Tax及其M22、M47突变蛋白对T淋巴细胞中HMGB1基因的转录调控情况（Tax/Neo）。Tax及其突变型Tax M22、Tax M47瞬时转染到HJ稳定细胞株（HJ1~HJ8），pCMV-Neo质粒作为对照，比较不同HJ细胞株中HMGB1的相对荧光素酶活性（Tax/Neo）。通过细胞接触逆转录病毒转染法，HTLV-1+的MT-2细胞（Hut-78细胞作为对照）分别与HJ稳定细胞株（HJ1~HJ8）以1:4的比例进行共培养，比较每种细胞株中HMGB1的相对荧光素酶活性［（MT-2）/（Hut-78）］。比较Tax蛋白对瞬时表达HMGB1基因和稳定表达HMGB1基因的转录调控差异。观察BAY11-7082/NF-κB抑制剂对Tax蛋白诱导HMGB1基因转录的影响。结果：HMGB1在不同种类细胞中的调控趋势大致相似，均表现出587bp长度HMGB1（-504~+83）的启动子活性最高。HTLV-1+T细胞（MT-4、MT-2）中HMGB1的转录活性略低于HTLV-1-T细胞（Jurkat、TaxP）。比较TaxN（Tax-）和TaxP（Tax+）细胞中HMGB1的转录活性发现，Tax蛋白促进pHLuc6～pHLuc8质粒中HMGB1基因的转录。不同pGL3-HMGB1-luc报告基因与pCMV-Tax共转染到Jurkat细胞也显示，Tax蛋白对-975~+83HMGB1基因影响不明显，但促进pHLuc6～pHLuc8报告基因中HMGB1的转录表达。随着Tax剂量的增加，pHLuc6质粒中HMGB1的转录活性明显增强。Tax及其突变型Tax M22、Tax M47与pHLuc3或pHLuc6共转染至Jurkat细胞发现，Tax及其M22、M47突变蛋白对pHLuc3质粒中HMGB1转录调控影响不明显，而促进pHLuc6质粒中HMGB1基因的转录。BAY11-7082/NF-κB抑制剂不影响Tax蛋白调控HMGB1基因的转录。结论：-504~-383可能是HMGB1转录激活的关键启动子区，Tax蛋白可能结合在HMGB1的-1163~-975区段诱导其转录，但不是通过NF-κB途径进行的。第四部分富集Tax蛋白的HMGB1基因生物信息学分析及Tax蛋白对其基因转录调控机制的研究目的：探讨Tax蛋白影响人T淋巴细胞HMGB1转录调控的基因片段、顺式作用元件和转录因子。方法：TaxP细胞经固定、超声和染色体免疫共沉淀（ChIP）处理后获得纯化的DNA，通过特异性引物，实时定量PCR扩增中心位点于-1103和-797处的HMGB1基因，寻找Tax蛋白富集在HMGB1的基因部位。应用生物信息学初步分析HMGB1-1163~-975区段的反式作用因子结合位点，通过野生型pHLuc6分别对其顺式作用元件实施缺失突变，构建不同突变型pHLuc6报告基因。在Jurkat中瞬时共转染pCMV-Tax和突变型pHLuc6（野生型pHLuc6作为对照），或pCMV-Tax（pCMV-Neo作为对照）和突变型pHLuc6，24h后检测荧光素酶活性，比较Tax蛋白对野生型和突变型pHLuc6中HMGB1的转录调控差异，寻找Tax蛋白影响人T淋巴细胞HMGB1基因转录的关键转录因子。结果：ChIP纯化后的样本经实时定量PCR扩增后，我们发现Tax蛋白在HMGB1-1103基因（-1163～-1043）的富集信号明显强于-797基因（-848～-746）的信号。即Tax蛋白主要富集在HMGB1的-1163~-975区段。生物信息学分析获知，HMGB1-1163~-975区段有6种反式作用因子（AML-1a、AP-1、CdxA、USF、v-Myb和C/EBP）。使用野生型pHLuc6，分别针对每种转录因子的顺式作用元件进行缺失突变，重新成功构建分别针对上述6种转录因子的突变型pHLuc6，依次命名为mLuc6-AM、mLuc6-AP、mLuc6-Cd、mLuc6-U、mLuc6-M、mLuc6-C。瞬时共转染pCMV-Tax和野生型pHLuc6或其突变型pHLuc6至Jurkat细胞后，发现突变型mLuc6-C中HMGB1的转录活性低至野生型pHLuc6的52％，并且在Jurkat细胞中Tax蛋白不影响mLuc6-C中HMGB1基因的调控表达。结论：Tax蛋白富集在HMGB1的-1163~-975区段，可能通过转录因子C/EBP调控HMGB1基因的转录表达。了解Tax蛋白影响HMGB1基因转录的调控机制，为ATL的临床治疗提供了一个新途径。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411

【参考文献】