广东汉族人群杀伤细胞抑制性受体P58识别HLA-C的分子基础研究

发布时间：2020-08-22 20:11

【摘要】： 造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)移植的难点是HLA全相合移植供源严重缺乏和移植后的移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)。最近免疫抑制性受体的研究为GVHD防治提供了新的思路。杀伤细胞(包括NK细胞和细胞毒性T细胞)是参与GVHD发生的重要效应细胞，而其细胞内的杀伤细胞抑制性受体(Killer cell inhibitory receptors,KIR)是调节其免疫杀伤活性的关键分子。P58分子是KIR家族成员，包括P58.1和P58.2，依据其结构特点可分为2DL1、2DL2、2DL3和2DL4。P58分子的特异性配体是靶细胞膜上的人类白细胞抗原C(humanleukocyte antigen C,HLA-C)，二者的结合具有严格的特异性，结合后可向细胞内传导抑制性信号，抑制其对靶细胞的杀伤作用。 国外已比较系统的对该信号传导系统进行了研究。至今，国内未见P58基因结构与功能的研究报道，我们对广东人群P58分子结构特点及HLA-C识别特异性进行了分析研究，并初步探讨了该信号系统与GVHD状态的关系。 1、SSP基因分型法和特异引物PCR方法分析了117例广东人P58、HLA-C基因的分布类型及基因频率。流式细胞仪分析法分析了P58基因在免疫细胞亚群中的表达分布及P58~+细胞比率。HLA-C基因分布以P58.2结合型(HLA-Cw1、3、7)为主，基因分布频率分别为：0.37、0.23和0.43。P58.1结合型(HLA-Cw2、4、5、6)基因频率低于0.05。HLA-C基因分布频率依次为：HLA-Cw7＞HLA-Cwl＞HLA-Cw3＞HLA-Cw4＞HLA-Cw2＞HLA-Cw5。未能检出HLA-Cw5、9、10基因。结果表明，该人群HLA-C基因分布主要为P58.2结合型，与国外报道的泰国人群及高加索人群比较有明显差异，为该人群特有。 P58的2DL1，2DL2，2DL3，2DL4基因在广东人群中均有分布，基因频率分别为：0.69、0.41、0.56和0.86．其中2DL4的分布频率最高，几乎分布于所有广东人，在98％的受检者中检测到该基因的存在，基因频率为0.86。其次为2DL1，而2DL2的基因分布频率最低。 第一军医大学搏士学位论文 结果证明，广东汉族人群中P58分子的4个亚型分布频率与泰国人群及高加索 人群比较有显著群体差异性；HLA（基因分布为P58．2结合型，主要为HLA－CWI、 cW3和CW7，分布频率与国内外报道有差异性，为该人群特有。ZDLZ及特异性配 体基因频率同时高于其它人群，表明是优势遗传和同步进化的结果。 2、用流式细胞仪分析分析了P58分子在兔疫细胞亚群中的表达分布。P58表达 于 NK、CD3”、CDS”和 CD4”细胞，其中 NK细胞中的表达LL率最高（P58．l为 480， P58．2为64％），其次为CDS”（P58．l为12O，P58．2为20o）、而CD4”细胞低于7o。 P58＊和P58．2在各细胞亚群中的表达分布变化模式一致，P58．2“细胞的比率高于 P58．l”细胞（Prt．of卜结果表明，广东汉族人群P58分子在NK、CD3、CD4、CDS 亚群细胞表达，且主要集中于NK和CDS细胞亚群，CD4亚群细胞中的表达比率较 d＼。 3、特异引物PCR法扩增、自动测序和生物学软件分析了P58识别HLA－C的 分子基础。P58分子特异识别和结合HLA－C区域，即DI、DZ区的氨基酸序列与国 外报道序列比较具有一致性和差异性，一致性表现在特异识别HLA（的第44位 氨基酸为赖氨酸或精氨酸，个别序列为天冬酚胺，与国外报道基本一致。差异性主 要在P58表达肽的多变区，即第40～80位氨基酸序列，突变有2～3种。ZDLI的 氨基酸突变点主要位于 44（M—N工 49（L－T入 52（A－QL 68（R－P＼ 70（T 一M）、77（N—S）、80（N—K）位。ZDLZ的氨基酸突变点主要位于 47（L—P）、 48（I—L）、57（V—S）、67（M—K）、69（F—T－M）、73（G～A）、78（Y～P）、 164（P—V）位。ZDL3的氨基酸突变点主要位于 47（I—A）、48（P—H）、57（V 一A）、67（M—K）、69（Q—Y）、73（G—P）、78（T—Y）、164（A—B）位。 4、SSSS MODEL 自动模拟系统模建、SPDV软件显示、分析，人工观察、 对比、分析了P58分子的原子结构图、电势能、分子表面形态差异。第44位氨基 酸不同的P58分子的分子构型、表面形状和电势能结构图有明显差异；第44位氨 基酸相同，而HLA－C结合区其它氨基酸不同的P58分子的基本分子构型具有相似 5 第一军医大学博士学位论文 性，但分子表面形状和电势能有一定差异。HLA（特异结合区的个别氨基酸突变可 明显引起分子构型、表面形状和电势能等变化，影响P58－HLA（结合面上氢键、 盐桥形成，因而影响P58与HLA（结合的亲和力及稳定性。广东汉族人群中P58 分子的配体识别位点及结合区的氨基酸序列、三维空间结构有多态性。P58分子的 配体识别位点（第44位氨基酸）的氨基酸差异明显影响三维空间构象（包括分子 结构、电势能、分子表面形态等人 配体结合区任何氨基酸突变均对三维空间结构 有一定影响，这是P58分子的人群、个体多态性的基础。结果显示广东汉族人群中
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392.1
【图文】：

在紫外光观察下在19000一2000obP间显示明显一条带，结果与预计一致。0D260/280比值在1.8左右，DNA浓度测定在5一16ug/ul之间，用DNA分离试剂盒提供的HZO稀释2一sug/ul浓度。DNA鉴定结果符合实验要求，电泳结果见图1。对提取的总RNA进行电泳观察和OD比值、浓度测定，结果与预计一致，鉴定结果符合实验要求。RNA在电泳胶中显示28、18和5S三条带，表明RNA完整性好，没有发生明显降解，结果见图2。，oD26o/280比值在2.0左右，核酸浓度在1一10u留ul之间，用RNA分离试剂盒提供的HZo稀释lu岁ul浓度。图1纯化基因组DNA电泳鉴定图图2纯化总RNA电泳鉴定图(显示285，185

对提取的总RNA进行电泳观察和OD比值、浓度测定，结果与预计一致，鉴定结果符合实验要求。RNA在电泳胶中显示28、18和5S三条带，表明RNA完整性好，没有发生明显降解，结果见图2。，oD26o/280比值在2.0左右，核酸浓度在1一10u留ul之间，用RNA分离试剂盒提供的HZo稀释lu岁ul浓度。图1纯化基因组DNA电泳鉴定图图2纯化总RNA电泳鉴定图(显示285，185，55)2HLA一C基因分布频率本研究广东人群中HLA一C的基因检出率及基因频率见表2。HLA一C的基因分布类型主要为P58.2特异结合型，即HLA一Cwz、Cw3、Cw7、Cws，其中HLA一Cw7的分布频率最高

2DL1PCR产物电泳鉴定图

【共引文献】

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本文编号：2801092