精子特异性LRRC52的生理学功能
发布时间:2020-09-20 21:24
阐明精子功能调控机制是诊断和治疗男性不育、研发新型男性避孕药的前提。离子通道是调控精子功能的关键因子。精子特异性SL03通道是生理条件下调控精子功能的主要K+通道。离体实验表明,睾丸特异性表达的LRRC52(Leucine-Rich-Repeat-Containing protein52)具有调节SL03通道的功能。然而,LRRC52是否为SL03的在体调节亚基尚不清楚。本研究设计、制备抗LRRC52胞外段的多克隆抗体,对小鼠和正常人精子LRRC52生理功能及其机制进行研究。应用分子生物学、免疫荧光、电生理及精子功能分析等手段,我们发现LRRC52是SL03通道的在体调节亚基,是介导精子钾电流(IKSper)的关键组分。此外,我们的结果还提示,LRRC52可作为设计精子功能调控化合物的分子靶点。 第一部分LRRC52在小鼠成熟精子的表达、定位及与SLO3的关系 为获得能从细胞外特异性作用于LRRC52的化合物,我们设计制备了抗LRRC52胞外段的多克隆抗体(LID1)。通过Western blot、精子凝集实验、免疫荧光和免疫共沉淀等技术,我们验证了所获抗体的特异性,研究了在体条件下LRRC52与SLO3的相关性。结果表明:1)小鼠精子蛋白中可检测到LRRC52, LID1孵育的精子发生明显的凝集反应;2) LRRC52分布于小鼠精子尾部,尤以中段明显,并与SLO3存在明显的共定位;3)小鼠精子LRRC52与SLO3构成蛋白复合体。这些结果提示,LRRC52是SLO3的潜在调节亚基。 第二部分LRRC52对小鼠成熟精子膜电流的影响 为阐明LRRC52的生理功能,我们应用全细胞膜片钳技术研究了LID1对精子膜电流的影响。结果表明:1)LID1显著抑制小鼠IKSper但不影响精子钙电流(ICatSper);2) LID1对IKSper电导.电压曲线(G-V曲线)的影响与异体表达系统中LRRC52亚基对SL03的作用相符。这些结果提示LRRC52是构成精子钾通道、介导精子钾电流的重要组分。 第三部分LRRC52对小鼠成熟精子生理功能的影响 应用计算机辅助精子分析(CASA)、金霉素(CTC)染色、体外受精(IVF)、调节性体积下降(RVD)检测等实验手段,我们观察了LID1对精子活力、顶体反应(AR)、体外受精能力及RVD等相关生理功能指标的影响。结果表明:1)LID1显著抑制小鼠精子总运动力、直线速度(VSL)、曲线速度(VCL)和平均路径速度(VAP);2)LID1不影响自发性AR的发生率,但显著抑制A23187诱发的AR发生率;3)LID1孵育对精子RVD能力的影响不显著;4)LID1显著抑制小鼠精子的体外受精率。这些结果提示,LRRC52在精子生理功能中扮演重要角色,是开发调控精子功能化合物的潜在分子靶点。 第四部分LRRC52在人成熟精子的表达及其生理功能 介导人精子IKSper的离子通道分子组成尚不清楚。由于用于制备LID1的LRRC52抗原片段在小鼠与人完全相同,我们用LID1初步观察LRRC52在人精子的表达及其可能的生理功能。结果表明:1) LRRC52和SLO3均在人精子蛋白中有表达,二者主要分布于精子尾部中段;2)LID1降低人精子顶体反应的发生率;3)LD1抑制人精子总运动力和曲线速度(VCL)。这些结果提示,LRRC52可能扮演与其在小鼠精子上类似的功能角色。
【学位单位】:南昌大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2013
【中图分类】:R321.1
本文编号:2823166
【学位单位】:南昌大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2013
【中图分类】:R321.1
【参考文献】
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本文编号:2823166
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