消银方及依巴斯汀对咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的疗效观察及作用机制研究

发布时间：2020-10-17 19:30

　　 银屑病是一种常见的免疫相关性慢性炎症性皮肤病，其病程长，易复发，对患者身心健康影响很大。银屑病发病机制复杂，是环境、遗传等多因素参与的以皮肤慢性炎症为表现的皮肤病，主要由T淋巴细胞免疫介导，其中CD4+T淋巴细胞免疫功能异常尤为重要。过去的研究多认为银屑病病程中存在Th1/Th2细胞平衡的异常。近年来发现了一类CD4+T淋巴细胞的新亚群——Th17细胞，它能分泌IL-17、IL-22等细胞因子，在银屑病发病过程中起了关键性作用。Th17细胞产生IL-17A、IL-17F、IL-22，以及Th1细胞产生INF-γ、TNF-α，这些介质作用于角蛋白细胞，导致角质形成细胞激活、增殖，并产生一系列细胞因子，进一步诱导了T细胞、中性粒细胞等向表皮迁移，形成恶性循环。由此可见，Th1和Th17细胞在银屑病发病中起到了至关重要的作用。抑制Th1、Th17细胞增殖及其下游细胞因子的分泌可有效缓解银屑病。 咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型是近几年来应用较广的动物模型，能快速诱导出与人类银屑病相似的皮肤表现，其临床特征、组织病理和发病分子学特征与人类银屑病发病机制极为相似，能有效模拟人类银屑病，并可进一步被用于阐明银屑病发病机制、评估新疗法的疗效。 消银方是长海医院治疗银屑病的经典组方，能有效改善、控制银屑病病情，并且价格低廉，副作用相对较小。依巴斯汀是一种无镇静作用的H1受体拮抗剂，有研究表明依巴斯汀可以抑制T细胞增殖和分泌IL-4, IL-5, IL-6以及TNF-α等细胞因子。 本课题研究研究目标是在成功构建咪喹莫特诱导的小鼠模型基础上，进一步观察消银方和依巴斯汀作用后，小鼠模型皮损的组织学改善情况和皮损中Th1、Th17细胞下游细胞因子的变化，来探讨消银方的作用机制及依巴斯汀治疗银屑病的可能性。 第一部分咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型的建立及评价 [研究目的]构建咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型，为进一步药物作用机制研究奠定基础。 [研究方法]选用BABL/c小鼠是模型动物，取背部2cm×1.5cm区域脱毛，空白对照组背部无毛区每日涂抹蒸馏水约0.5ml，模型组背部无毛区涂以5%咪喹莫特乳膏，60mg/天，连续6天。观察小鼠涂药区皮肤变化情况。造模结束后，肉眼观察小鼠背部皮肤有无红斑、鳞屑及严重程度；两组小鼠脱臼处死，取背部皮损制作石蜡切片行HE染色，观察表皮厚度及炎症细胞浸润情况。 [结果]肉眼观察空白对照组皮肤无明显红斑鳞屑，模型组经背部皮肤逐渐出现红斑，并长出黏着性银白色鳞屑。HE染色镜下观察模型组较空白对照组表皮明显增厚，炎细胞浸润数明显增多。 [结论]通过5%咪喹莫特诱导构建的银屑病小鼠模型在临床上可较好的模拟银屑病。 第二部分消银方、依巴斯汀等药物治疗咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型的疗效评价 [研究目的]研究消银方和依巴斯汀治疗咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型的疗效，并进一步验证小鼠模型模拟银屑病的有效性。 [研究方法] BABLc小鼠54只，随机分为9组（I—IX组），每组6只。背部脱毛，I组为空白对照组， II-IX组背部无毛区每日涂以5%咪喹莫特乳膏连续6天建模，建模成功后，8个模型组每两天仍需涂抹咪喹莫特乳膏一次，以保持银屑病模型的稳定性。给药方案：II组为模型对照组，不给药；III-IX组依次给予生理盐水（0.5ml/d）、消银方（2.88g/kg.d）、依巴斯汀（3.03mg/kg.d）、复方甘草酸苷（22.75mg/kg.d）、雷公藤多甙（9.1mg/kg.d）、地塞米松（1.02mg/kg.d）、环孢素A（27.30mg/kg.d）药液每日灌胃治疗，疗程2周。治疗结束后处死小鼠，取背部皮损组织，平均分为三份，其中两份立即置于﹣80℃冰箱保存备用，一份投入预先配好的固定液10%福尔马林液中固定。治疗过程中拍照记录皮损处红斑鳞屑变化情况。制作皮损石蜡切片行HE染色，计数各组炎症细胞浸润数和纵向表皮面积值，并进行统计学比较。 [结果]通过肉眼观察，治疗2周后， IV组、VI组、VIII组红斑鳞屑较前有所好转，其中VIII组鳞屑厚度较前明显变少变薄；II组、III组、V组、VII组、IX组红斑鳞屑较治疗前无明显改善。 浸润细胞数的多重比较显示，空白对照组低于其他各组（P均小于0.05）；模型对照组与生理盐水组均高于其他各组（P均小于0.05）；消银方组低于依巴斯汀组与复方甘草酸苷组（P均小于0.05），与环孢素A组、雷公藤组、地塞米松组无明显差异；依巴斯汀组高于消银方组（P＜0.05），与复方甘草酸苷组、环孢素A组、雷公藤组、地塞米松组无明显差异。 纵向表皮面积值的多重比较显示，空白对照组低于其他各组（P均小于0.05）；模型对照组与生理盐水组均高于其他各组（P均小于0.05）；消银方组低于复方甘草酸苷组、环孢素A组、依巴斯汀组（P均小于0.05），与地塞米松组、雷公藤组无明显差异；依巴斯汀组与其他各组均有差异，除低于模型对照组与生理盐水组外，均高于其他组（P＜0.05）。 [结论]咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型能有效模拟人类银屑病，并可用于药效学研究。消银方和依巴斯汀治疗银屑病小鼠模型有不同程度的疗效，可有效降低小鼠模型皮损中炎症细胞浸润数量，抑制表皮细胞过度增殖。 第三部分消银方、依巴斯汀等药物治疗咪喹莫特诱导银屑病小鼠模型的作用机制研究 [研究目的]比较消银方和依巴斯汀治疗后，银屑病小鼠模型皮损中TNF-α、IFN-γ、IL17、IL22等细胞因子在基因及蛋白水平上的差异，从而探索其作用机制。 [研究方法]取第二部分中冻存于-80℃冰箱的小鼠皮损组织，分别提取RNA和总蛋白，应用实时定量PCR、Western blot分别检测TNF-α、IFN-γ、IL17、IL22等细胞因子mRNA和蛋白表达。 [结果]空白对照组TNF-α、IFN-γ、IL17、IL22mRNA和蛋白表达均显著低于模型对照组与生理盐水组；消银方治疗后小鼠皮损内四种细胞因子mRNA表达较模型对照组均明显下降，其中IL-17mRNA表达下降最明显；依巴斯汀治疗后较模型对照组TNF-α、IFN-γ、IL-17mRNA表达明显下降，但IL-22mRNA无明显变化。TNF-α、IFN-γ、IL17、IL22蛋白表达符合mRNA表达差异。 [结论]消银方与依巴斯汀治疗能有效降低银屑病小鼠模型皮损中细胞因子mRNA及蛋白表达，其中消银方作用较为全面，对Th1细胞因子TNF-α、IFN-γ以及Th17细胞因子IL17、IL22均有显著降低作用；依巴斯汀亦对Th1、Th17细胞通路均有抑制作用，但主要作用于Th1细胞通路，能显著抑制TNF-α、IFN-γ的分泌。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R758.63;R-332
【部分图文】：

二、实验结果（一）外观肉眼评价I 组（空白对照组）皮肤无明显红斑鳞屑（图 1），II 组经外涂 5%咪喹理的背部皮肤逐渐出现红斑，并长出黏着性银白色鳞屑（图 2）。

模型组建模后皮肤逐渐变红并长出银白色鳞屑（二）HE切片染色法观察

HE染色（×200）
【参考文献】

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本文编号：2845230