丙型肝炎病毒蛋白相互作用蛋白基因克隆化及Hcbp6功能研究

发布时间：2020-10-18 01:11

　　 丙型肝炎病毒(HCV)属黄病毒科，可以引起急慢性肝炎、肝硬化及肝癌，目前世界上有1.7亿人感染，治疗上只有干扰素和利巴韦林，但是疗效有限。此病毒表达十种蛋白，C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b，在病毒的复制中各有不同的功能，但有些具体功能还不清楚。HCV的致病机制及对免疫的调节可能与病毒蛋白对肝细胞或淋巴细胞的作用有关，为了研究病毒蛋白质对肝细胞的作用，利用九十年代初出现的酵母双杂交技术，进行了文库筛选，以期筛选出与病毒蛋白相互作用蛋白基因。 根据全长HCV-H cDNA，我们设计了HCV核心蛋白基因(HCV-H株的342-914nt)、NS2基因(2769-3419nt)、NS3基因(3420-5312nt)的引物，进行扩增，连接到pGEM-T载体中测序证实后，酶切连接到酵母双杂交“饵”载体pGBKT7中，转化AH109(a型)酵母株，转化成功后，表达各自蛋白，用Western blotting确定蛋白表达。把转化好的AH109酵母菌，与含有肝cDNA文库的酵母菌Y187(α型)进行配合，在铺有x-α-gal 内’削子拟芮。毒蛋白用互作口蛋臼基囚秃隆化及HCbp6功能研究－2－第三贝共1刀 贞 的三缺、四缺培养基上进行筛选。提取兰色酵母菌落的质粒，测 序进行生物信息学分析。所获得的未知功能基因存入 GenBank「AY032593（HcBPI）、AY032594（HcBP6）、AF395068（。BP12）、 AF43595（NS3BP）」，感兴趣的己知与未知基因进行确定性的再次 酵母双杂交实验，及体外免疫共沉淀实验以证实真正的相互作 用。 发现HCV核心 蛋白可以与HU HCbPI，HC HCbp6，HU HCbplZ 以及Translin蛋白相互作用，Translin是转位蛋白，在淋巴瘤 发病中起重要作用，HCV感染病人的淋巴瘤发病率明显高于正常 人，所以HCV核心蛋白与转位蛋白的相互作用，可能是其发病的 部分原因。 为研究 HU HCBP6 蛋白的功能，我们把它的基因连接到 PEGF＊CI中，转化HePGZ、NIH 3T3、COS－7细胞系，在荧光显 微镜下定位，发现此蛋白质定位在细胞器中。在此过程中发现此 蛋白质具有刺激细胞生长作用，为了进一步确定是否有促进细胞 生长作用，对其进行了MTT代谢实验，发现代谢明显高于正常， 说明具有明显的促进细胞生长作用。 为了进一步研究其有无致瘤性我们正在进行这方面的研究。 HU HCbP12蛋白质的功能还不清楚。 这些未知蛋白基因的克隆成功，为今后HCV的致病机理的研 究提供了线索，特别是HU HCbp6具有促进细胞生长作用，可能 与肝癌的发生有关，HCV核心蛋白与转位蛋白的相互作用与淋巴 瘤和肝细胞癌的发生有关。
【学位单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R373.21
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
前言
主要仪器设备
英文缩略词
第一部分 HCV各基因的酵母双杂交“饵”载体的构建与表达
    引言
    第一节 HCV核心蛋白酵母双杂交“饵”载体的构建与酵母中表达
    第二节 HCVNS2酵母双杂交“饵”载体的构建与酵母中表达
    第三节 HCVNS3酵母双杂交“饵”载体的构建与酵母中表达
    讨论
第二部分 酵母双杂交筛选
    引言
    第一节 酵母双杂交筛选与HCV核心蛋白相互作用蛋白基因
    第二节 酵母双杂交筛选与HCVNS3相互作用蛋白基因
第三部分 体外免疫共沉淀实验
    引言
    第一节 未知基因及感兴趣已知基因的克隆化
    第二节 体外表达
    第三节 体外免疫共沉淀
    讨论
第四部分 Hcbp6基因功能研究
    引言
    第一节 Hcbp6在细胞内定位
    第二节 Hcbp6对细胞生长的研究
    第三节 Hcbp6蛋白质对HCV核心蛋白反式激活的影响
    讨论
总结
攻读博士学位期间发表的文章
文献综述一
文献综述二
致谢

【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 何晓瑜;HCBP6基因过表达载体和RNAi载体的构建及其功能学研究[D];山西医科大学;2011年

本文编号：2845569