环境流行病学研究中全血长期保存与RNA提取方法

发布时间：2020-10-18 13:06

　　 RNA是在基因表达层面探究分子生物学机制的重要研究对象.由于RNA化学性质活泼、结构不稳定,并且内外源RNA酶无处不在,如何从环境流行病学研究收集到的全血样本中提取出高质量的总RNA是困扰研究人员的一大难题.本研究旨在建立一种能长期保存全血样本并从中提取出高质量总RNA的方法.通过将环境流行病学研究中采集到的少量新鲜全血立即与10倍体积的TRIzol试剂混匀后置于-80℃冰箱中,可保护RNA在长期保存过程中不发生降解.针对长期保存的全血-TRIzol混合体系,在经典的TRIzol一步法基础上,无需将全血样本分装至不含RNA酶的1.5 mL离心管,直接在较大操作空间(不含RNA酶的15 mL离心管)中进行总RNA相分离、沉淀、洗涤等操作,并在总RNA晾干前再增加离心并吸取少量残留液体操作,缩短自然晾干时间.本方法无需离心、分离血浆、裂解红细胞等繁杂的前处理步骤,极大地简化了操作步骤,减少了采样工作量,实现了对全血样本的低成本长期保存.通过增大操作空间、改进晾干操作,本方法显著提高了总RNA样本的完整性和纯度.使用本方法提取出保存一年的全血总RNA产率为(9.18±2.10)μg·mL~(-1),完整性指标RIN值和28S/18S分别为8.98±0.18和1.08±0.08,纯度指标OD_(260)/OD_(280)和OD_(260)/OD_(230)分别为2.18±0.04和1.70±0.00.保存两年的全血提取出总RNA的产率、完整性及纯度仍然可以满足下游实验要求.
【部分图文】：

表2 总RNA产率、完整性及纯度指标Table 2 The yield, integrity and purity of total RNA 组别 RNA产率/(μg·mL-1) RNA完整性 RNA纯度 RIN值 28S/18S OD260/OD230 OD260/OD280 A组 9.18±2.10 8.98±0.18 1.08±0.08 2.18±0.04 1.70±0.00 B组 9.14±2.52 8.46±0.21* 1.00±0.10 2.10±0.07 1.88±0.04** C组 4.86±1.03* 7.78±0.33** 0.92±0.15 0.76±0.22** 1.90±0.00NA D组 7.78±2.57 3.76±1.43** 0.28±0.15** 0.66±0.17** 1.94±0.05** 注:与A组相比,*p<0.01,**p<0.001,T检验.图2 Agilent 2100生物分析仪中总RNA电泳图谱

图1 Agilent 2100生物分析仪中总RNA凝胶样图谱表2中A组总RNA产率为(9.18±2.10) μg·mL-1,即从保存一年的0.5 mL全血中提取出约4.6 μg总RNA,满足下游分析对RNA总量的要求.A组样本的完整性指标RIN值和28S/18S分别为8.98±0.18和1.08±0.08.RIN值较高,满足高通量测序RIN值大于7.0的要求.28S/18S均值大于1.0,但相对偏低,与理论值相差较大,说明样品完整性受到一定影响.但综合RIN值和28S/18S两项指标,说明全血按本方法保存一年后提取出的总RNA完整性较好.图1显示A组样本凝胶样图谱中28S和18S条带清晰,图2中A组样本电泳图谱基线平整,没有降解杂峰,28S和18S的峰形清晰且突出.A组样本的OD260/OD230和OD260/OD280分别为2.18±0.04和1.70±0.00,表明本方法提取出的总RNA纯度较高.总的来说,全血按本方法保存一年后提取出的总RNA产率高,完整性较好且纯度较高,满足下游分析对RNA的质量要求.
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本文编号：2846335