PPARγ对骨髓MSC向心肌样细胞分化的影响及调控作用的研究

发布时间：2020-10-19 11:10

　　 研究背景： 心肌细胞在出生后就不能再生，对有丝分裂信号的反应是细胞肥大而不是增生。心肌细胞的丧失会导致所在区域心肌收缩功能减退，以致心力衰竭，坏死心肌终而被成纤维细胞形成的疤痕组织所取代。近年来，采用自体细胞和生长因子修复组织的再生医学迅猛发展。有人将培养的心肌细胞移植到损伤区心肌内能够明显改善心功能，并称之为“细胞心肌成形术”(cellular cardiomyoplasty)，有可能成为治疗心力衰竭的有效手段。许多作者对胚胎干细胞诱导成心肌细胞进行了大量研究，并取得了显著进展。但是，胚胎干细胞移植仍然存在许多问题，诸如免疫排斥，伦理道德问题等。继胚胎干细胞后，骨髓间充质干细胞(MSC)受到了高度重视。来源于中胚层的MSC，是多能干细胞，在诱导后可以定向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞以及肌腱细胞等多种细胞。MSC与心肌细胞同属于中胚层。近期已经有人应用5-氮杂胞苷(5-Aza)成功地将体外培养的MSC诱导成为心肌样细胞。Tomita等将人骨髓MSC植入免疫缺陷鼠心肌后，发现这些细胞可分化成为心肌细胞，且表达心肌细胞特有的desmin,α-actin，β-MHC2。有作者将骨髓MSC注射入心梗边缘部位心肌内，这些移植的MSC分化成为心肌细胞，且受损的心功能得到明显改善。进一步研究表明，MSC经5-Aza诱导后分化为心肌样细胞再行移植受损心肌部位，疗效明显优于未诱导组。目前对于骨髓MSC定向分化为心肌样细胞的研究处于起步阶段，心肌样细胞定向分化率仍然不高，对于心肌分化的调控机制研究甚少。因此，深入研究MSC分化过程中的调控机制对于寻求控制干细胞分化方向的手段，从而提高MSC向心肌样细胞定向分化率，促进细胞心肌成形术的应用有重要意义。 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ)作为核激素受体超家簇中的成员，是细胞分化重要的调控因子。通过调节其他转录因子的表达，参与调节MSC分化，并在诱导MSC分化不同特异性表型之间起到开关作用。PPARγ在MSC向心肌样细胞分化过程中的作用如何，目前尚无相关报道。 资料显示，Nkx 2.5、GATA4、MEF-2C等基因是调控心肌细胞分化开始阶段的重 第三军医大学博士学位论文 要转录因子。本文应用培养小鼠MSC为研究材料，以5一Aza作为诱导剂，叫睬美辛 作为PPARY的配体，利用表达载体pEGFP一1一PPA助2转染MsC，检测PPA助对细 胞分化及其对转录因子MEF一ZC、Nkx2.5、GATA4 mRNA表达的影响，旨在探讨PPA助 对MSC分化为心肌样细胞的影响及其在分化过程中的调控作用。 方法与结果: 第一部分:探讨了小鼠MSC的体外分离、纯化、扩增、多向诱导和向心肌样细 胞定向分化的诱导条件。首先采用密度为1.082留ml的Percou细胞分离液分离小鼠骨 髓细胞中的单个核细胞，所获细胞应用DME树低糖培养基+l0%胎牛血清进行培养， 通过及时、反复传代对MSC进行纯化和扩增。平均5一6d在细胞达到80%左右融合时 进行传代。采用流式细胞仪检测细胞周期。应用不同的诱导方法对细胞进行多向诱导 分化，使细胞向成骨细胞、成心肌样细胞、成脂肪细胞三个不同的方向分化。诱导成 心肌样细胞分化时选取了5一Aza3林mol/L、5林mol/L、10林mol/L三种不同浓度。应用四 环素荧光标记检测钙结节，油红O染色检测脂滴，免疫组织化学检测ThT表达。 结果:MSC细胞形态保持均一的短梭形。12一14d细胞长成单层。细胞生长曲线: 第1、Zd细胞数量无明显增加，第3d开始细胞数量明显增加，MSC在第7d达到最 高峰。第8d开始进入平台期。细胞周期结果显示:MSC中GI期的细胞占91 .74%， S+GZ的细胞约占8.26%，表明只有少数细胞进入了活跃增殖期。成骨诱导后，细胞 出现钙结节。成脂诱导的细胞胞浆内出现大量脂滴。成心肌样细胞诱导中以5-Aza 3林mol几浓度为最佳，诱导后l月，部分细胞TnT表达阳性。5一Aza以5林mol/L及 10娜ol/L浓度诱导后虽有肌管样结构出现，但TnT表达始终呈阴性。 第二部分:应用叫噪美辛作为P队RY的配体作用于MSC以激活PPA助。将细胞 分为4组:A组用5一Aza3林mol/L诱导细胞分化;B组分别采用叼}噪美辛10一、10一，mol/L 两种不同浓度作用于MSC，观察细胞生长情况，形态变化;C组联用5一Aza鸿}噪美辛 作用于MsC;D组为对照组，不诱导。应用油红一O检测脂滴，免疫组织化学检测PPARY 表达情况。 结果:叫噪美辛在10一mol几浓度时对细胞有明显的毒性，而10一smol/L时细胞生 长良好。对照组及单用10一，mol几叫睬美辛作用Msc时，PPA助表达均呈阴性。单用 叫垛美辛并不能诱导MSC分化。单用5一Aza3卜mol几诱导后的第3d，部分细胞PPARY 表达阳性。联用6一Aza/叫噪美辛诱导时发现，诱导后第3d几乎所有细胞PPA助表达 阳性，继续培养后分化为脂肪细胞。 第三军医大学博士学位论文 第三部分:分题卜重组表达载体pCAG一PPARYZ及pEGFP一Nl。将前者中的 PPA助2目的片段构建入后者中。采用5’端一粘性末端一3’端平端构建策略对目的基因 进行亚克隆，构建成pEGFP一Nl一PPA助2表达载体。酶切鉴定与测序鉴定相结合。分 题2:经鉴定正确的重组质粒用脂质体转染法转染入MSC，应用吼;:并采用休克法进 行筛选?
【学位单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

细胞即可完全融合，细胞排列仍有规则的方向性。细胞生长曲线(见图1一l)，第1、Zd细胞数量无明显增加，第3d开始细胞数量明显增加，MSC在第7d达到最高峰。第8d开始进入平台期。二、MSC的成心肌诱导培养(见照片4、照片5)经5一Aza诱导后，细胞生长速度明显减缓，以10娜of几浓度最为明显，5林mol/L次1112厂厂1110卜.——--一一777ttt，8}—一一一一一一一一子=一一一一-—一一知知心}III曹曹6卜一一一一.一一-一子—一一一界界}///444卜.一—一子一一一一一一一一一一一一一222卜.一-一=尸乙—一一~一.一一000Les~习一一Lreeses匕es习eseseses习eseseseses‘esesesesLeseseses‘eseses曰曰1112345678999天天数数图图1一1MSCs生长曲线线FFFigl一1ThegrowtheurveofMSCsss之。诱导gd后

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第三军医大学博士学位论文图3-1pEGFP一l表达载体及其多克隆位点Fig3一1TheexPressionveetorPEGFP一1anditsmultiPlecloningsiteFig3一23一2pCAG一PPAR丫2表达载体TheexPressionveetorPCAG·PPAR丫2
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 周进明,邹仲敏,郭朝华,何颖,张勇,王劲,王蒙,罗成基,程天民;小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定[J];第三军医大学学报;2002年01期

2 王劲;DNA甲基化[J];国外医学(临床生物化学与检验学分册);2002年04期

本文编号：2847121