粉尘螨HSP60的基因克

发布时间：2020-10-27 23:58

　　 目前，过敏性疾病已成为全球关注的公共卫生问题。尘螨广泛存在于人类居室环境的尘埃中，它作为一种重要的变应原在变态反应学研究中受到高度重视。尘螨可引起支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎等多种变态反应性疾病，严重影响人类健康。而尘螨中包含的引起变态反应的成分-尘螨变应原在研究中一直受到高度关注。并且，随着探索的深入,不断有新的尘螨变应原被识别和发现，这极大地加深了人类对尘螨变应原的认识，推动了尘螨过敏性疾病诊断、预防和治疗的进步。通常寄生虫的HSPs作为一种蛋白质有较好的免疫原性，一方面，有诱导宿主产生变态反应，成为粉尘螨变应原的潜在可能；另一方面，有作为抗原用于尘螨过敏性疾病特异性免疫预防和治疗的潜力。因此，本课题组在既往研究的基础上，选择粉尘螨热休克蛋白60（Heat shock protein60，Hsp60）为研究对象，以期探索和发现粉尘螨新的变应原组分，并对其免疫学特性进行初步研究。 研究目的： 以粉尘螨Hsp60为研究对象，测定和分析它的cDNA序列，克隆表达出高纯度的Hsp60蛋白片段，用重组蛋白与尘螨过敏病人血清反应，对该蛋白是否可能是变应原进行初步评估。 研究方法： 1、粉尘螨总RNA的提取用Trizol提取总RNA。 2、粉尘螨cDNA的合成及PCR扩增以提取的RNA为模板逆转录合成cDNA，根据与尘螨相近物种Hsp60蛋白的特征性和保守序列设计简并性引物，以cDNA为模板PCR扩增Hsp60基因片段。 3、测序及氨基酸序列分析将扩增获得的PCR产物进行测序，将测序后碱基序列编码的氨基酸序列进行同源性分析，并对氨基酸序列进行亲水性区域分析。 4、粉尘螨Hsp60基因片段的扩增和TA克隆根据测序结果设计特异性引物，并加入酶切位点，PCR扩增Hsp60基因片段，然后连接到PMD18-T载体上，并将阳性重组质粒送公司测序。 5、粉尘螨Hsp60基因片段亚克隆将TA克隆质粒和pET-32a(+)质粒分别双酶切，然后将目的基因片段连接在pET-32a(+)上，构建pET-32a(+)-Hsp60原核表达载体。 6、重组蛋白的表达与纯化将阳性重组质粒转化入大肠杆菌表达系统进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE电泳观察表达情况，并进行可溶性分析。将表达的重组蛋白经Ni-NTA层析柱纯化。 7、重组蛋白Western blot鉴定以尘螨过敏病人血清为一抗与纯化的重组蛋白反应，以羊抗人IgE-HRP为二抗，最后用ECL化学发光法显示Western blot结果。 8、重组蛋白质谱分析将纯化的重组蛋白SDS-PAGE电泳条带切下后送公司做蛋白质谱检测。 研究结果： 1、提取粉尘螨的RNA，逆转录合成cDNA，用简并引物成功扩增出约520bp大小的PCR产物。测序结果显示其碱基序列与Achromobacter Xylosoxidans Hsp60相似度为86%，其碱基编码的氨基酸与Advenella Mimigardefordensis Hsp60相似度可达92%。 2、成功的构建了原核表达载体pET-32a(+)-Hsp60，并表达出大小为37KD左右的重组蛋白，经Ni-NTA层析柱纯化后获得纯度较高的可溶性目的蛋白。 3、纯化的重组蛋白经Western blot鉴定，能与尘螨过敏病人血清中的IgE反应。 4、质谱分析结果显示：重组蛋白为Hsp60。 结论： 1、结合免疫印迹、蛋白组学分析技术对尘螨新变应原进行分析和筛选是一种有效的方法，为新的尘螨变应原的发现提供了一种新的技术线路。 2、本研究通过简并引物PCR和基因测序方法首次确定了粉尘螨Hsp60部分cDNA序列。 3、通过基因克隆和大肠杆菌原核表达技术成功表达出粉尘螨Hsp60（片段）重组蛋白。且它能与粉尘螨过敏患者血清的IgE发生特异性结合，从而获得了Hsp60可作为粉尘螨变应原的重要证据。
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R392
【部分图文】：

RNA 的浓度为 139μg/ml。1%琼脂糖凝胶电泳（图 1），可见有 28S、18S、5S 三条带，显示 RNA 完整性较好。图1 粉尘螨总RNA的提取Fig.1 Extraction of RNA from Dermatophagoides farinae2 粉尘螨 Hsp60 基因片段的扩增和序列分析2.1 Hsp60 基因片段的 PCR 扩增用简并引物对粉尘螨 cDNA 进行初次 PCR 扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，未见明显目的 DNA 条带。故将初次扩增产物稀释 10 倍，用稀释后产物做模板再次扩增，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，可见明显的大小约 520 bp 的 DNA 扩增条带，结果如图 2 所示。（上述 PCR 扩增反应共重复 3 次，均得到大小相同的扩增产物。）

粉尘螨 Hsp60 基因片段 PCR 结果R amplification of Dermatophagoides DNA Marker DL2000; Lane 1: PCR的测序与分析ACGCGGTATCGACAAAGCCGTTACTGCAGCAAGGAAATCGCCCAGGTTGGTTCGACGCCATGGACAAAGTAGGCAAGGGCTTGACGTGGTTGAAGGCATGCAATCAAGCAGGTTTCCGTACTGGAAGACCTCTGCTGCCCATCCTGGAACAGGTTGGGGCGAAGCCCTGGCTACGCTGGTTGACCAGGATTTGGTGACT （下划

图 3 粉尘螨氨基酸序列同源性分析结果Fig.3 Homology analysis for amino acid sequence of Dermatophagoides farinae2.2.4 蛋白质构成、性质与亲水性分析结果：Number of amino acids: 173Molecular weight: 18691.4Theoretical pI: 4.70Amino acid composition:Ala (A) 15 8.7%Arg (R) 5 2.9%Asn (N) 8 4.6%Asp (D) 16 9.2%Cys (C) 1 0.6%Gln (Q) 5 2.9%Glu(E) 11 6.4%
【参考文献】

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本文编号：2859265