小鼠卵母细胞成熟是一多阶段精细有序调控的过程。小鼠卵母细胞生发泡破裂标志着卵母细胞成熟的开始。生发泡破裂后,微管在前中期围绕染色体开始组装,染色体逐渐迁移至纺锤体的中部,而后者在MⅠ期形成椭圆形双极结构。随后,纺锤体迁移至细胞皮质,并排出第一极体,细胞进入第二次减数分裂中期,在此期纺锤体紧贴于质膜下方。目前卵母细胞在胞浆中含有超过80个小的微管组织中心蛋白。有丝分裂体细胞中心体形成双极纺锤体的两极,促进微管成核和纺锤体装配。减数分裂卵母细胞微管组织中心含有围中心粒物质成分：γ-tubulin and pericentrin,后者是一种关键蛋白,用于把γ-tubulin固定在中心粒周围。在前中期,微管组织中心开始聚集以形成纺锤体极。卵母细胞微管组织中心的功能与有丝分裂细胞中心体类似,对减数分裂纺锤体组装是必须的,但微管组织中心的组成结构及如何调节微管成核和组装机制目前并没有很好阐明。NIMA蛋白激酶是以构巢曲霉菌蛋白激酶命名的一种激酶,参与广泛的有丝分裂进程。哺乳动物的NIMA基因编码11种NIMA激酶,报道显示NIMA蛋白激酶家族是有丝分裂进展中的关键分子,参与了许多重要的有丝分裂过程,如有丝分裂前期中的中心体分离,染色体浓缩,前中期中的核膜破裂和纺锤体组装,以及有丝分裂周期的退出和细胞骨架分离。Nek9属于NIMA蛋白激酶家族,是一分子量107kD的多肽,它的氨基催化末端连接有一段与RCC1同源的序列,后者是小G蛋白Ran的交换因子。在细胞分裂间期,Nek9的RCC1区域可以直接与激酶的活性部位结合起自身抑制作用。哺乳动物细胞中发现Nek9与γ-tubulin蛋白共沉淀,并且激活的Nek9多肽在早期细胞分裂过程中定位于中心体和纺锤体极上。Nek6和Nek7激酶是Nek9的下游激酶,激活后促进有丝分裂进展,而如果敲减其活性或表达活性衰减的突变体则导致有丝分裂阻滞和细胞凋亡。PLKl激酶可以激活Nek9,促使有丝分裂驱动蛋白Eg5蛋白上Ser1033磷酸化,后者与CDK1激酶一起,对中心体分离和及时进入有丝分裂周期起关键作用。丝裂原激活蛋白激酶系统(MAPK)是一组苏/络氨酸蛋白激酶家族,参与一系列的包括细胞增殖、分化、凋亡、应激反应等关键的细胞生命进程。ERK8是胞外信号调节激酶家族(ERK)中新发现的蛋白激酶,与ERK7拥有69%相同的氨基酸序列。ERK8促进增生细胞核抗原蛋白(proliferating cell nuclear antigen; PCNA)的稳定,后者参与基因信息的传送、协调、和刺激过程。目前已知(Human double minute2; HDM2)蛋白参与PCNA降解过程。ERK8可以阻止PCNA和HDM2结合从而抑制PCNA降解。ERK8还参与调控细胞周期。降低ERK8表达影响正常的细胞增殖。在MCF-10A细胞,ERK8是调节增殖速率的限速因子,控制细胞进入S期。降调ERK8导致cyclin D1、cyclin E、p27表达增高,和cyclin A水平下调。降调ERK8表达后,细胞增殖速率下降大约2倍。不过,ERK8的功能仍不清楚,关于其上游激活成分和下游效应蛋白的信息仍了解很少。其在减数分裂中的作用也不清楚。考虑到减数分裂过程的精确调控对于可受精的卵子的产生及后代的健康十分重要。目前关于Nek9和ERK8激酶的研究主要集中在有丝分裂中方面,对于他们在哺乳动物减数分裂中的作用及其在早期受精卵中的研究尚未见报道,我们提出了Nek9和ERK8在小鼠卵母细胞减数分裂过程和早期受精卵卵裂中发挥作用的假设。系统研究了他们在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的表达、定位、功能情况以及其在受精卵早期胚胎中的分布情况。本研究包括两个部分。 第一章Nek9调节小鼠卵母细胞减数分裂纺锤体组装和细胞周期进展及其在早期胚胎中的分布 目的：Nek9在有丝分裂中起重要作用,但其是否参与减数分裂过程中无中心体的纺锤体组装和染色体的分离调控还有待研究。本研究探讨其在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的表达、定位、功能情况以及其在受精卵早期胚胎中的分布情况。 方法：我们先后进行卵母细胞和受精卵培养、对各期卵母细胞或受精卵早期胚胎进行免疫印迹试验、免疫荧光试验和激光共聚焦扫描检测；紫杉醇和诺考达唑处理减数分裂中期的卵母细胞；Morpholino显微注射、染色体铺片实验、活细胞动态观察录像实验等实验方法,探讨其在小鼠卵母细胞减数分裂过程具体的作用和早期受精卵卵裂中的分布。独立重复的实验数据用平均数±标准误表示,观察的卵子数目用括号表示(n=)。用SPSS软件进行差异分析。p0.05被定义为差异显著。 实验结果：Nek9在小鼠卵母细胞减数分裂成熟中均有表达和定位：Western blot检测发现,Nek9在卵母细胞成熟的各个阶段都有表达,且各期表达量并无明显差异。免疫荧光实验显示GV期,Nek9定位在生发泡内。生发泡破裂后,Nek9聚集在浓缩的染色体周围,在Pro-MI、MI期,Nek9主要定位在纺缍体的两极上。在在第一次减数分裂的后期和末期,Nek9主要定位在分离的同源染色体中间和卵母细胞和极体间的中体上。在MⅡ期,Nek9再次回到纺缍体的两极上。Nek9与γ-tubulin共定位进一步证实Nek9在减数分裂期主要分布在纺锤体的两极上。Nek9在受精卵和早期有丝分裂期胚胎中的亚细胞定位与卵母细胞减数分裂相类似。当卵母细胞进入第二次减数分裂的末期并排出第二极体,Nek9迁移至细胞中体上。在受精卵两原核期中,Nek9呈点状分布在受精卵原核内。随着原核的破裂,Nek9开始在染色体周围聚集,有丝分裂纺锤体开始形成。在前中期和中期,Nek9稳定的表达在第一次有丝分裂纺锤体的两极上。当合子进入第一次有丝分裂后期和末期时,Nek9移动到已分离染色体之间的中部或细胞中体,当第一次有丝分裂完成后,受精卵形成2细胞胚胎间期,Nek9再一次出现在细胞核内。当用纺锤体干扰剂处理减数分裂中期中的卵母细胞后,我们发现在紫杉醇处理组的卵子中,Nek9和γ-tubulin信号不仅在异常的纺锤体极上出现并完全重叠,同时也出现在异常的胞质星体上。在诺考达唑处理的卵子,微管完全解聚,纺锤体消失,Nek9信号消失在胞浆中。当诺考达唑处理的MI期卵子彻底清洗并培养30分钟来促进微管的再组装,Nek9又重新出现在重组的纺锤体细胞器的两极上。接下来我们采用在卵子中采用Morpholino(MO)抑制Nek9表达,观察卵母细胞Nek9受到抑制后其减数分裂的发生情况。免疫印迹分析显示Morpholino处理组Nek9的表达明显降低,证明Nek9敲减效率是成功的。在Nek9-MO处理组,卵母细胞表现出多种形态异常的有缺陷的纺锤体和排列紊乱的染色体。主要的纺锤体紊乱是异常的纺锤体极,(52%,n=94)主要包括：无极,单级,多极纺锤体,其他紊乱包括超长的纺锤体,和异形的纺锤体伴有星型微管,并出现明显的染色体排列异常。Nek9-MO注射处理组异常纺锤体的比例(62.2±1.6%,n=94)明显高于对照组(26.1±1.3%,n=92)p0.05)。而且,Nek9-MO处理组排列紊乱染色体的比例(69.2±0.6%,n=94)与对照组相比(28.1±2.3%,n=92)也有显著差异。我们的研究发现,Nek9在减数分裂成熟过程中始终和γ-tubulin共定位,接下来,我们进一步研究了Nek9敲减后对γ-tubulin的作用。在对照MO组,γ-tubulin在MI期位于纺锤体的两极,而在Nek9-MO显微注射处理组,y-tubulin不再聚集在纺锤体的两极,而是不规则的散落在纺锤体纤维上或弥散在细胞浆中。由于Nek9敲减影响了纺锤体组装而导致大量卵子阻滞在前中期和中期,我们推测染色体是否也不能得到正确的分离。我们将Nek9MO处理组和对照组的卵子培养12小时后进行染色体铺片分析。染色体铺片证实Nek9降调后影响了染色体分离。在Nek9降调组,染色体铺片显示染色体仍为2倍体,(10/10)；而在对照组卵母细胞,同源染色体已分离,染色体为单倍体形式(9/9),提示后期已完成。接下来,我们研究了检验点蛋白Bub3在Nek9-MO处理组卵母细胞的分布情况。在Nek9-MO实验组,细胞即使经过10小时培养仍阻滞在前中期或中期,特异性的检验点蛋白Bub3信号仍可以被检测出。而在对照组,细胞进入后期,Bub3信号消失, Bub3信号提示在Nek9降调后,纺锤体检验点被激活。最后,我们采用活细胞实时摄像显示：在对照组,生发泡破裂后4小时可观察到减数分裂纺锤体,并且纺锤体缓慢移至卵子皮质,并大约在生发泡破裂后9小时排出第一极体。形成对比的是,在Nek9-MO显微注射处理组,各种不同的形态缺陷的纺锤体可以被观察到,染色体不能分离,甚至在生发泡破裂后12小时后还能发现卵子被阻滞在前中期或中期。而且,在Nek9-MO显微注射处理组中,没有发现有第一极体排出。 结论：我们的研究显示Nek9可能是一种中心体相关蛋白,在小鼠卵母细胞减数分裂过程中对纺锤体组装,纺锤体极形成,染色体排列,第一极体排出都起重要作用。 第二章ERK8在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用和在早期胚胎中的分布 目的：研究ERK8在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的表达、定位、在受精卵早期胚胎中的分布情况,以及其在卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用。 方法：我们先后进行卵母细胞和受精卵培养、对各期卵母细胞或受精卵早期胚胎进行免疫印迹试验、免疫荧光试验和激光共聚焦检测、紫杉醇和诺考达唑处理减数分裂中期的卵母细胞、siRNA或抗体显微注射等实验方法,探讨其在小鼠卵母细胞减数分裂过程具体的作用和早期受精卵卵裂中的分布。独立重复的实验数据用平均数±标准误表示,观察的卵子数目用括号表示(n=)。用SPSS软件进行差异分析。p0.05被定义为差异显著。 结果：ERK8实验结果显示：ERK8在卵母细胞成熟的各个阶段都有表达,且各期表达量并无明显差异。免疫荧光实验显示在GV期,ERK8未发现有明确的定位。在生发泡破裂后,ERK8开始迁移至染色体的周围。在第一次减数分裂前中期、中期、后期、末期和第二次减数分裂中期,ERK8稳定地分布在纺锤体微管上。ERK8信号和α-tubulin信号共染实验进一步证实ERK8在减数分裂中的定位。受精卵和早期有丝分裂期胚胎免疫荧光实验显示在两原核期受精卵,未发现明显的ERK8信号。当原核核膜破裂后,ERK8开始聚集在染色体的周围并开始定位在有丝分裂纺锤体微管上。当受精卵进入有丝分裂后期, ERK8信号仍和α-tubulin有着同样的定位方式。当第一次有丝分裂完成,形成二细胞胚胎且细胞均进入间期时,和在原核期类似,此时无ERK8信号被检测到。在观察到ERK8在第一次和第二次减数分裂中期均定位在纺锤体上之后,我们研究了其与微管的相关关系。紫杉醇是一种微管稳定剂,紫杉醇处理的卵母细胞微管纺锤体过度聚集,并且在胞质中形成典型和众多的星体,ERK8信号出现在异常的纺锤体上和胞质星体上。接下来,用诺考达唑处理MⅠ和MⅡ期卵母细胞使其微管降解,经过10分钟诺考达唑处理,微管已完全解聚,此时ERK8从纺锤体消失,弥散在胞质中。为了研究ERK8在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用,我们首先采用抗体注射破坏ERK8蛋白的生物学活性。我们用ERK8抗体或免疫球蛋白G注射生发泡期的卵母细胞。在ERK8抗体注射组,卵母细胞显示出各种不同类型的纺锤体缺陷和排列异常的染色体表型。主要的纺锤体异常是无极纺锤体。其他的异常包括单极纺锤体、多极纺锤体、多极纺锤体和小纺锤体、长纺锤体和非成型的纺锤体伴有胞质星体。ERK8抗体注射组在出现严重纺锤体异常的同时多半也伴有染色体排列紊乱,包括轻度排列紊乱和严重排列异常。与对照组(23.2%±2.7%,n=217)相比, ERK8抗体注射组(57.1%±4.9%,n=185,p0.05)纺锤体异常比例明显增高,有统计学差异。ERK8抗体注射组中(60.4%±3.8%,n=185)染色体异常比例同时也较对照组(20.6%±1.8%,n=217,p0.05)明显增加。我们进一步采用ERK8siRNA干扰观察卵母细胞减数分裂成熟情况。在ERK8-siRNA降调组,大多数卵母细胞表现出明显异常的纺锤体和染色体表型。ERK8-siRNA显微注射组异常纺锤体比例(59.3±3.5%,n=159)较对照组(25.3±1.5%,n=155)明显增加,(p0.05)。ERK8siRNA降调组染色体异常比例(60.5±3.8%,n=159)与对照组(30.6±3.4%,n=155,p0.05)相比,也明显增加。最后,我们发现大多数ERK8siRNA组卵母细胞被阻滞在前中期/中期,而对照组细胞多数进入MⅡ期,ERK8siRNA组极体排放率(31.1±2.8%,n=144)明显低于对照组极体排放率(63.4±4.2%,n=157,p0.05)。与ERK8siRNA干扰试验结果相似,ERK8抗体显微注射组的极体排放率(35.3±5.7%,n=114)明显低于对照免疫球蛋白注射组(72.7±2.8%,n=125,p0.05)。 结论：我们研究结果显示在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程和受精卵和早期卵裂期胚胎中,ERK8可能在微管组装方面起重要作用。进一步研究哺乳动物减数分裂中ERK8的上游激酶和可能的作用底物有重要意义。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R321.1
【文章目录】：摘要
ABSTRACT
第一章 Nek9调节小鼠卵母细胞减数分裂纺锤体组装和细胞周期进展及其在早期胚胎中的分布
摘要
1 前言
2 材料与方法
3 数据分析
4 实验结果
5 讨论
6 结论
7 致谢
8 参考文献
第二章 ERK8在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用和在早期胚胎中的分布
摘要
1 前言
2 材料与方法
3 数据分析
4 实验结果
5 讨论
6 结论
7 致谢
8 参考文献
综述一
参考文献
综述二
参考文献
中英文缩略词表
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
统计学合格证明
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