培养脊髓神经元线状溶酶体与细胞骨架蛋白—纽蛋白关系的研究

发布时间：2020-11-04 23:20

　　 目的 溶酶体是一个形态变化多样的运动性细胞器，传统上呈圆形或椭圆形。近来在不同类型的细胞中发现一种酸性磷酸酶阳性的长管状溶酶体，称其为线状溶酶体(nematolysosome NLY)。超高压电镜观察NLY在细胞内以分支网络结构形式存在，已有报导，NLY的形成及分布受细胞内环境及细胞外刺激的影响。一些细胞中可见NLY借分支与圆形溶酶体相连，一般认为NLY参与细胞内物质的转运。大量研究证明，在机体的多种细胞如中性粒细胞、内皮细胞、肝细胞、胰腺的腺泡细胞等都有NLY的广泛存在。在中枢神经系统中也有NLY的分布，在脊髓前角的运动神经元，其分布在胞体、轴突等，推测NLY参与神经元的轴突运输。 纽蛋白(vinculin)是一种细胞骨架蛋白。细胞骨架包括微丝、微管及中间丝。其中微丝主要为丝状肌动蛋白，其由球形的肌动蛋白单体聚合而成。在细胞膜内侧，其与vinculin、talin、a-actinin和fodrin等结合构成膜骨架或粘着类型连接等结构。由于上述几个蛋白均与肌动蛋白结合存在，又称其为肌动蛋白结合蛋白。纽蛋白做为一个粘着连接相关蛋白，其作用是在细胞-细胞或细胞-基质间的连接中，将肌动蛋白连接于细胞膜，其在细胞的连接、蔓延及固定中有重要的作用。同时，在细胞外信号向内传导方面也有作用。 溶酶体是由细胞高尔基复合体形成的以酸性磷酸酶为主要标志酶的细胞器，其作用是参与细胞内、外物质的吞噬与消化。此过程包括如下几个步骤：初级溶酶体的形成、自噬和异噬的发生形成早期内吞体、早期内吞体酸化成熟形成晚期内吞体、晚期内吞体与溶酶体结合形成自噬溶酶体(次级 溶酶体人溶酶体内水解酶对吞噬物消化后，进行细胞内的再利用或形成残 余体。溶酶体在自噬及异噬过程中可呈线状、球形或卷曲形，此过程受细胞 骨架的调节，且微丝与微管分别在不同的步骤对其进行调节。 已有报导，肌动蛋白丝主要促进内吞体的形成及晚期内吞体与溶酶体 的融合，此过程也有肌动蛋白结合蛋白的参与。用细胞松弛素（肌动蛋白 丝解聚剂）B或D处理细胞可见细胞内自噬泡形成减少，认为自噬泡的形 成与微丝的聚合与解聚有关。另有报导，用细胞松弛素D处理角膜上皮细 胞可引起纽蛋白分布的改变，提示纽蛋白的分布是微丝依赖的；用佛波醇酯 泽MA）处理细胞引起线状溶酶体的形成，也引起纽蛋白免疫荧光染色的变 化。上述研究是否提示纽蛋白与线状溶酶体的形成有关？纽蛋白是一个粘 着类型连接相关蛋白，在异物吞噬过程中是否有纽蛋白的参与？国内J尚 未见报导。 本实验拟采用原代脊髓神经细胞培养、免疫细胞化学、电镜酶细胞化学 及共焦激光扫描显微镜等方法对脊髓神经元纽蛋白的表达及其与肌动蛋白 丝之间的关系、线状溶酶体的分布及其影响因素及纽蛋白与线状溶酶体之 间的关系进行研究。从而，对神经细胞内细胞骨架蛋白的分布、作用及线状 溶酶体的形成等有更深的了解；填补细胞学理论及细胞骨架蛋白该方面研 究的空白。 实 验 方 法 1．原代细胞培养及施加处理因素：取出生12 h内乳鼠，无菌取脊髓， 剪碎、消化、离心，加 DMEM制成细胞悬液，加人预先置有盖玻片及ACLAR 膜的培养板中培养。待细胞成熟，分别向培养基中加人细胞松弛素D＊D 组）、PMA（PMA组）及DMSO（对照组）。 2．免疫组化ABC法及免疫荧光法染色：取长有神经细胞的盖玻片及 ACLAR膜，用4％多聚甲醛固定后，分别进行小鼠抗人hVIN－1的免疫组 化ABC法、免疫荧光法染色及组织蛋白酶D的免疫荧光法染色，然后进行 hVINJ的免疫电镜显示，以显示纽蛋白及组织蛋白酶D在原代培养的脊 髓神经元的分布。在光学显微镜及电子显微镜下观察、照相。 3．ACP酶的光、电镜酶细胞化学方法显示：取长有细胞的盖玻片及 ·二· ACLAR膜，2％多聚甲醛刀．25％戊二醛的固定液固定，ACP酶孵育液中孵 育，80分，37℃，孵育液配方采用［mori’s的方法配制，硫化胺显色，甘油明 胶封片，光学显微镜观察、照像。见阳性结果后对ACLAR膜培养的脊髓神 经元进行常规电镜标本制备，原位倒扣包埋、聚合。聚合后剥去ACLAR 膜，显微镜下定位脊髓神经元，超薄切片机切片，醋酸铀单染，透射电镜观 察、照相。 4．免疫荧光双标记技术：取出长有神经细胞的盖玻片用4％多聚甲醛 固定 15 分钟，正常驴血清（donkey八 1：50）及羊血清（Sheep）（1：50）混匀， 封闭非特异性染色，一抗孵育：将小鼠抗人组蛋白单克隆抗体门：400）及兔 抗人组织蛋白酶抗体（工作液）混匀，滴于盖玻片上，湿室，4℃过夜，二抗孵 育：将FITC标记的donkey－anti·－Rabbit IgG（绿）（二：50）及Texas－Red标 记的 sheep－anh－Mouse IsG红色）（l：50）混匀，滴于蓝玻片上，湿室，Zh， 室温对W洗后，甘油一PBS封片，共焦激光扫描显微镜（eica TCS－SPZ，北 京医科大学细胞所／ 643nr。双通道激发，观察结果，计算机存盘。 实验结果 1．相差显微镜观察 原
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2002
【中图分类】：R329
【部分图文】：

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图1一巧培养神经元局部放大显示纽蛋白在胞质内呈网格样分布looK图1一16免疫电镜显示纽蛋白在CD处理培养神经元的分布20K可见纽蛋白在细胞膜下的分布明显减少，且胞质及突起内出现空泡(*)及断裂。42

图2一5原代培养脊髓神经元中ACP酶分布可见部分高尔基复合体板层呈阳性反应(t)。30K图2一6CD处理原代培养脊髓神经元中ACP酶阳性的溶酶体加K可见核周线状溶酶体增多(t)。46
【共引文献】

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本文编号：2870757