HIV-1Env特异性单克隆抗体的筛选与异型二价单克隆抗体的初步研究

发布时间：2017-04-05 20:02

  本文关键词：HIV-1Env特异性单克隆抗体的筛选与异型二价单克隆抗体的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：中和抗体是HIV-1感染者体内保护性免疫反应的一个重要组成部分，因此寻找具有广谱中和活性的单克隆抗体一直是HIV-1治疗和疫苗研究的一个重要方向。 近几年发展出了几种高通量、高灵敏度的抗体筛选方法。其中基于B细胞分选和单细胞RT-PCR的方法使得筛选到的抗体能更好地反映自然感染状态下的抗体形态，但此方法依赖于流式细胞仪，而流式细胞仪非常昂贵，限制了此方法的普遍应用。因此，本文采用了操作更简易的免疫磁珠细胞分选来代替流式细胞分选，同样获得了与HIV-1Gp120抗原特异性结合的B细胞，并从获得的单个B细胞中扩增抗体基因，在体外表达获得了Env特异性单克隆抗体。 本研究采集HIV-1感染者抗凝全血，分离外周血单个核细胞，利用生物素标记的HIV Gp120抗原与B细胞膜上的IgG特异性结合，然后用链霉亲和素标记的磁珠分选出能够产生Env特异性抗体的记忆性B细胞。将获得的B细胞稀释至单细胞水平，用单细胞RT-PCR法从记忆性B细胞中扩增抗体的重链可变区基因与轻链可变区基因，并克隆到相应的表达载体中。然后将携带重链基因的质粒与携带轻链基因的质粒共转染293T细胞，获得HIV-1特异性人单克隆抗体，并进行抗体结合活性与中和活性的鉴定。结果从1例我国HIV-1感染者记忆性B细胞中筛选出3株对HIV-1Env抗原有结合活性的单克隆抗体。其中有2株主要与Gp140和FLSC结合，1株与Gp120、FLSC和Gp140均可结合且结合活性无明显差异，但筛选到的单克隆抗体没有中和活性。 有研究表明，构建针对不同抗原表位的异型二价抗体，能提高抗体对病毒的亲和力，中和活性也可能得到增强。由于我们筛选得到Env特异性单抗中有很大一部分没有或只有较弱的中和活性，但如果将这些单抗混合应用，能否产生协同作用，发挥更好的中和效果尚不清楚。因此本文也对此进行一些探索。 首先通过微量中和实验分析了本科室前期筛选到的单克隆抗体的协同中和作用，发现4组单克隆抗体(IF4/3H2、IF4/CD4、2A5.4/1F4、2A2/3H2)具有协同中和作用。对这些抗体进行基因改造，将两个不同单抗组合成一个异型二价单克隆抗体。具体构建方法为：首先通过基因定点突变的方法在重链载体恒定区引入T270Y或Y311T突变，构建两种含有点突变的表达重链恒定区的载体IgG-T270Y和IgG-Y311T，使这两种重链恒定区共同表达时在突变位点形成一个“knob-in-hole”的结构，从而促进异型二价单抗的形成。同时为了便于检测，在IgG-T270Y的重链恒定区的CH3区的C端引入FlAG标签，在IgG-Y311T的重链恒定区的CH3区C端引入6×His标签。然后采用重叠PCR的方法将单抗的重链和轻链可变区连接到一起形成单链抗体（single chain Fv，scFv），，将scFv克隆到改造后的重链恒定区表达载体上，构建了3H2-FLAG、1F4-His、CD4-FLAG、2A2-His、2A5.4-FLAG。将携带两种抗体可变区基因的质粒共转染293T细胞，收集上清，纯化并鉴定异型二价单克隆抗体是否成功表达，进一步研究其中和活性。结果只有CD4-FLAG/1F4-His、1F4-His/3H2-FLAG得到了成功表达，且中和活性比改造前的同型单抗有所提高，CD4-FLAG/1F4-His对SF162假病毒的IC50为2.3μg/mL；1F4-His/3H2-FLAG对SF162假病毒的IC50为2.4μg/mL。 综上所述，利用生物素标记HIV Gp120抗原，并用链酶亲和素标记的磁珠对细胞进行分选，结合单细胞RT-PCR技术可以成功筛选出抗原特异性的单克隆抗体。部分无中和活性或中和活性较弱的两种单抗联合应用可发挥协同作用，利用基因改造的方法与重叠PCR方法可以将抗体改造成一个异型二价的双效单克隆抗体，而且在相同浓度条件下，人工异型二价双效抗体比同型抗体的中和活性更强。
【关键词】：单细胞PT-PCR 免疫磁珠 单克隆抗体 结合活性 中和活性
【学位授予单位】：北京工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.91;R392.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 主要英文缩写词8-10
• 目录10-12
• 第1章 绪论12-20
• 1.1 HIV 特点12
• 1.2 中国艾滋病疫情12
• 1.3 艾滋病疫苗研究进展12-14
• 1.4 中和抗体14-16
• 1.4.1 中和抗体的作用14-15
• 1.4.2 中和抗体的筛选15-16
• 1.5 异型二价单克隆抗体的研究进展16-17
• 1.6 课题背景17-18
• 1.7 本研究的内容和意义18-20
• 第2章 利用磁珠分选和单细胞 RT-PCR 筛选 HIV-1 Env 特异性单克隆抗体20-40
• 2.1 材料20-26
• 2.1.1 血样20
• 2.1.2 细胞20
• 2.1.3 试剂以及相关溶液配制20-21
• 2.1.4 合成引物21-26
• 2.1.5 主要实验仪器26
• 2.2 方法26-34
• 2.2.1 生物素标记 Gp120 抗原26-27
• 2.2.2 HIV-1 Env 特异性记忆 B 细胞的分选27
• 2.2.3 单细胞 RNA 的制备27
• 2.2.4 抗体重链可变区基因与轻链可变区基因的扩增27-29
• 2.2.5 克隆抗体基因29-31
• 2.2.6 抗体基因比对分析31
• 2.2.7 单克隆抗体的制备与纯化31-32
• 2.2.8 ELISA 法检测抗体特异性32-33
• 2.2.9 单克隆抗体的中和活性分析33-34
• 2.3 实验结果34-37
• 2.3.1 抗体重链可变区基因与轻链可变区基因的扩增34-35
• 2.3.2 抗体基因序列分析35-36
• 2.3.3 单克隆抗体与 Env 的结合活性分析36-37
• 2.3.4 单克隆抗体中和活性分析37
• 2.4 讨论37-39
• 2.5 本章小结39-40
• 第3章 HIV-1 异型二价单克隆抗体的初步研究40-55
• 3.1 材料40-42
• 3.1.1 细胞40
• 3.1.2 假病毒40
• 3.1.3 试剂与试剂配制40-41
• 3.1.4 实验仪器41
• 3.1.5 合成引物41-42
• 3.2 方法42-48
• 3.2.1 单克隆抗体的协同中和作用42
• 3.2.2 抗体基因改造与克隆42-46
• 3.2.3 异型二价单克隆抗体的制备与纯化46
• 3.2.4 异型二价单克隆抗体表达效果鉴定46-47
• 3.2.5 异型二价单克隆抗体中和活性分析47-48
• 3.3 结果48-52
• 3.3.1 单克隆抗体间的协同中和作用48-49
• 3.3.2 表达载体基因改造49-50
• 3.3.3 抗体可变区的扩增50-51
• 3.3.4 异型二价单克隆抗体表达效果鉴定51-52
• 3.3.5 异型二价单克隆抗体的中和活性鉴定52
• 3.4 讨论52-54
• 3.5 本章小结54-55
• 结论55-56
• 参考文献56-60
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文60-62
• 致谢62

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