去泛素化酶OTUD6A基因敲除小鼠的构建及表型初步分析

发布时间：2020-11-18 11:39

　　 目的建立去泛素化酶OTUD6A基因敲除小鼠模型,并对该模型进行初步表型分析。方法基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OTUD6A基因敲除小鼠;利用PCR、qPCR和Western blot技术(WB)分别在DNA水平、mRNA水平和蛋白水平上检测OTUD6A基因的表达;统计雄性OTUD6A纯合敲除(OTUD6A~(-/-))小鼠和雌性OTUD6A杂合子(OTUD6A~(+/-))小鼠交配所得后代各基因型小鼠比例及生长发育情况,对小鼠各组织器官利用苏木素-伊红染色(HE染色)进行病理学分析。结果成功建立OTUD6A基因敲除小鼠模型,该基因敲除小鼠可正常生长繁殖并符合伴性遗传定律。与同窝野生型(WT)小鼠相比,纯合敲除(OTUD6A~(-/-))小鼠在体型和体质量上无显著差异,主要组织脏器也无明显的病理学异常。结论成功构建OTUD6A基因敲除小鼠模型。纯合敲除(OTUD6A~(-/-))小鼠可正常生长发育,与WT小鼠相比无显著差异。
【部分图文】：

针对OTUD6A基因，经过在体外的sgRNA设计和构建、sgRNA的活性测试、Donor载体设计与构建，以及在体内的受精卵显微注射，获得阳性F0代小鼠。F0代杂合子小鼠和野生型背景鼠交配得到F1代小鼠（本部分由南京生物医药研究院完成）。经由图1A的繁配策略，可得到后代小鼠。PCR鉴定结果显示，WT小鼠仅能鉴定到切除前扩增出的单条基因片段，大小为246 bp;KO小鼠仅能鉴定到切除后扩增出的单条基因片段，大小为721 bp；杂合子（heterozygous,HET）小鼠则能同时鉴定到2条基因片段（图1B）。由此可见，基因组水平结果显示OTUD6A基因敲除小鼠已构建成功。2.2 OTUD6A基因敲除小鼠可正常出生和存活

图2 WB结果显示，OTUD6A在睾丸组织中特异性高表达，且OTUD6A KO小鼠各组织脏器中的OTUD6A蛋白被显著敲除，从而可从蛋白表达水平上证实OTUD6A基因敲除小鼠构建成功。与此同时，分别提取OTUD6A KO小鼠与WT小鼠睾丸组织的总RNA进行qPCR检测，从mRNA水平对OTUD6A基因敲除小鼠模型进行验证，结果显示两者OTUD6A的mRNA水平有显著差异（P<0.0001，图3）。图3 qPCR检测WT小鼠与KO小鼠睾丸组织中OTUD6A mRNA的表达水平

qPCR检测WT小鼠与KO小鼠睾丸组织中OTUD6A mRNA的表达水平
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