金黄色葡萄球菌GdpS蛋白与致病性相关的调控功能研究

发布时间：2020-11-18 12:40

　　 金黄色葡萄球菌是一种非常重要的人体致病菌,可以引发一系列疾病,从普通的皮肤类感染疾病,如丘疹、脓疱病、疔疮、烫伤样皮肤综合症,到可以致死的系统性感染疾病如肺炎、脑膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合症以及败血症等。金黄色葡萄球菌之所以能成为重要致病菌并引发如此众多的疾病感染,主要原因在于可以表达和分泌大量的毒性因子。这些毒性因子主要包括分泌型蛋白:丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶、核酸酶、溶血素、肠毒素、脂肪酶、凝固酵素,和细胞表面蛋白:蛋白质A(protein A),纤维蛋白原/胶原质-连接蛋白等。 近年来,3’,5’-环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号分子调控系统受到越来越多的关注。c-di-GMP最早作为木葡糖醋酸杆菌纤维素合成酶的别构激活子被发现,目前已被认定为广泛存在于细菌当中的第二信使信号分子,参与多种复杂的生理活动的调控。c-di-GMP是由一系列含有GGDEF结构域的蛋白合成并由含有EAL或者HD-GYP结构域的蛋白降解。尽管在很多细菌当中c-di-GMP做为第二信使行使功能已经被深入的研究,但是在一些低GC含量的革兰氏阳性细菌当中,c-di-GMP究竟扮演什么样的角色需要更多的研究来揭示。 全基因组测序信息显示金黄色葡萄球菌的基因组只编码了一个GGDEF结构域蛋白(GdpS),而没有EAL或者HD-GYP结构域的蛋白。本研究采用生物基因芯片、实时荧光定量PCR等技术比较野生型金黄色葡萄球标准菌株NCTC8325与其gdpS基因敲除株的基因表达差异。结果显示金黄色葡萄球菌中唯一的GGDEF结构域蛋白(GdpS)影响了一些毒性基因的表达。在gdpS基因敲除株中,一系列毒性因子的转录水平发生了变化,例如丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶、纤维蛋白原连接蛋白,尤其是蛋白A(protein A,Spa)。蛋白A是金黄色葡萄球菌中的一种重要的胞壁蛋白,可以和多种哺乳动物的免疫球蛋白IgG的Fc端结合并被认为是金黄色葡萄球菌免疫逃避机制的重要组成元件,蛋白A的致病性已通过多种动物模型得到证实。基于蛋白A的重要性,本研究对GdpS影响其表达的机制进行了更深入的探求。在gdpS敲除株中,编码蛋白A的基因spa的转录水平降低了约8倍。有趣的是,spa的一个正调控因子sarS的转录水平在gdpS敲除株中也有所下降,表明gdpS影响spa的表达可能通过sarS。为了证明这一点,我们在gdpS敲除株中转入含有编码全长gdpS的序列的互补质粒,结果发现spa和sarS的转录水平被都回补到了野生型的水平。而另一方面,同样作为spa表达的调节因子的agr、sarA、sarT和rot的转录水平在gdpS敲除株中则没有变化。因此,可以得出结论:gdpS影响spa的表达通过sarS而不依赖于agr、sarA、sarT、和rot。此外,互补实验的结果表明GdpS影响spa的表达依赖于其N-端结构域,而不依赖其C-端的GGDEF结构域,即GdpS影响spa的表达不依赖于c-di-GMP信号通路。
【学位单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R378
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1.1 金黄色葡萄球菌概述
        1.1.1 引言
        1.1.2 生物学特性
        1.1.3 流行病学
        1.1.4 致病性
        1.1.5 金黄色葡萄球菌的致病过程
            1.1.5.1 引言
            1.1.5.2 金黄色葡萄球菌的侵袭过程
            1.1.5.3 金黄色葡萄球菌的侵袭后过程
    1.2 金黄色葡萄球菌毒性因子
        1.2.1 引言
        1.2.2 分泌型毒力因子
            1.2.2.1 凝固酶
            1.2.2.2 肠毒素
            1.2.2.3 杀白细胞素
            1.2.2.4 蛋白酶
            1.2.2.5 毒力因子的分泌机制
        1.2.3 细胞壁毒力蛋白
            1.2.3.1 引言
            1.2.3.2 ECMBP 的结构概述
            1.2.3.3 识别纤连蛋白的 FnBP
            1.2.3.4 识别胶原蛋白的 Cna
            1.2.3.5 识别纤维蛋白原的 ClfA
            1.2.3.6 蛋白 A
        1.2.4 金黄色葡萄球菌和生物膜
            1.2.4.1 引言
            1.2.4.2 PIA
            1.2.4.3 与细菌黏附力有关的细菌产物
            1.2.4.4 金黄色葡萄球菌的自溶素
    1.3 金黄色葡萄球菌毒性因子调控机制
        1.3.1 引言
        1.3.2 双组分信号系统
        1.3.3 附属基因调节系统 Agr
        1.3.4 胞外蛋白表达调控系统 Sae
        1.3.5 自溶相关的调控系统 ArlSR
        1.3.6 LytRS
        1.3.7 辅助蛋白调控系统SarA（Staphylocccus aureus accessory regulator A） 及其同源物SarT,SarS,Rot
        1.3.8 毒性基因 spa 的表达调控网络
    1.4 cdiGMP 作为第二信使的功能介绍
        1.4.1 引言
        1.4.2 C-di-GMP 的合成和降解
        1.4.3 GGDEF 和 EAL 结构域蛋白在细菌中的分布
        1.4.4 GGDEF 和 EAL 结构域蛋白的组成
        1.4.5 c-di-GMP 的调控行为
        1.4.6 葡萄球菌中的c-di-GMP 的研究
第2章 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验菌株及载体
        2.1.2 实验所用引物
        2.1.3 实验所用试剂
        2.1.4 培养基
        2.1.5 主要仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 大肠杆菌化转感受态的制备
        2.2.2 大肠杆菌化转
        2.2.3 金黄色葡萄球菌电转感受态的制备
        2.2.4 金黄色葡萄球菌电转
        2.2.5 金黄色葡萄球菌基因组 DNA 的提取
        2.2.6 质粒的构建
            2.2.6.1 同源重组质粒的构建
            2.2.6.2 互补质粒的构建
        2.2.7 gdpS 突变株的构建
        2.2.8 生长曲线的测定
        2.2.9 生物膜实验
        2.2.10 自溶实验
        2.2.11 蛋白酶活性测定
        2.2.12 纤维连接蛋白连接实验
        2.2.13 Western blotting
        2.2.14 金黄色葡萄球菌 RNA 抽提
        2.2.15 RNA 反转录实验
        2.2.16 实时荧光定量 PCR
第3章 实验结果和讨论
    3.1 引言
    3.2 金黄色葡萄球菌中 GdpS 蛋白的生物信息学研究
    3.3 gdpS 突变株的生理实验
    3.4 GdpS 对基因转录组水平的影响
    3.5 GdpS 影响 Spa 的转录水平通过 SarS 调控通路
    3.6 GdpS 影响spa 的转录依赖其 N 端结构域
    3.7 讨论
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果

【引证文献】

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1 姜游帅;蜂胶对金黄色葡萄球菌毒力因子抑制作用研究[D];黑龙江八一农垦大学;2010年

本文编号：2888727