血管内皮细胞和中性粒细胞迁移的细胞骨架调控机制

发布时间：2020-11-19 21:03

　　 细胞迁移是许多细胞的基本特性,在许多生理和病理过程中起着重要的作用,比如血管新生和免疫应答等。迁移运动受内部和外部信号控制,这些信号激活复杂的信号传导级联反应,导致actin-myosin和微管细胞骨架高度动态和集中的重塑,以及细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用。一些微管相关蛋白通过与微管相互作用而参与到细胞极化和迁移过程中。 HOP是共伴侣蛋白家族的一员,它能通过TPR结构域直接与Hsp70和Hsp90相结合,促进多伴侣分子复合物的形成,调节它们的活性。除此之外,HOP还可以与其他分子伴侣相互作用,甚至还涉及一些与Hsp70/Hsp90分子伴侣体系无关的细胞活动过程。HOP在细胞运动及上皮细胞功能中的参与的角色还有很多未知。在第一部分研究中,我们证实HOP在血管内皮细胞迁移和血管新生中起到十分重要的作用。体外血管形成实验和细胞出芽实验揭示清除HOP表达会显著抑制血管从血管内皮细胞形成。划痕实验和transwell迁移实验显示HOP对血管内皮细胞迁移很重要。通过检查中心粒再定位和细胞膜皱褶动态性,我们发现HOP在应答迁移刺激的细胞极化的过程中起到重要的作用。更进一步的,我们的结果显示在血管内皮细胞中HOP与微管蛋白相互作用并与微管共定位。这些发现表明HOP是一个血管新生的新的调节因子,它能促进血管内皮细胞极化和迁移。 中性粒细胞是天然免疫中最多和最重要的细胞组分。在受到巨噬细胞的招募后,大量的渗出血管,进入到感染的组织部位识别、吞噬并清除病原体。其中,在粘附、迁移和吞噬等过程中中性粒细胞的actin细胞骨架发生高度变化。因此,actin动态性的调节对中性粒细胞在天然免疫过程中执行其功能起到关键作用。 研究证实已有许多因子参与到actin多聚化的正向诱导,但对潜在的负向调节因子的研究还很少。在第二部分研究中,我们发现在被刺激的中性粒细胞中,生理上基于NADPH氧化酶作用产生的活性氧(ROS)通过驱动可逆性actin谷胱甘肽化来负向调节actin多聚化。清除ROS会导致聚合型actin(F-actin)总量增加。Grx1是哺乳动物细胞中主要的催化actin去谷胱甘肽化的酶。干扰Grx1的表达会增加actin谷胱甘肽化,抑制actin多聚化；继而损害中性粒细胞的极化、趋化、粘附和吞噬作用。与之一致的,Grx1基因敲除小鼠的中性粒细胞募集到体内炎症位点的行动力受损,并且噬菌能力降低。相对的,过表达Grx1则会降低actin谷光甘肽化水平,增加F-actin含量。综上所述,这些结果表明在中性粒细胞的actin动态性调节过程中,Grx和ROS诱导的可逆性actin谷胱甘肽化占据重要的生理性地位。
【学位单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2013
【中图分类】：R329.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    第一节 细胞迁移中的细胞骨架
        1.1.1 细胞迁移
        1.1.2 细胞迁移中的微丝
        1.1.3 微管在细胞迁移的作用
    第二节 中性粒细胞
        1.2.1 中性粒细胞的产生和释放
        1.2.2 中性粒细胞募集到炎症部位的过程及调控
        1.2.3 中性粒细胞杀菌机制
    第三节 Hsp70/Hsp90 Organizing Protein（HOP）简述
        1.3.1 HOP的发现和遗传学信息
        1.3.2 HOP调节Hsp90和Hsp70活性
        1.3.3 HOP的TPR及其他功能性结构域
        1.3.4 HOP的其他生物学功能
    第四节 S-谷光甘肽化简述
        1.4.1 S-谷光甘肽化
        1.4.2 Grx（glutaredoxin）
        1.4.3 S-谷光甘肽化调节的细胞活动
第二章 HOP调节血管内皮细胞迁移
    第一节 材料、试剂与方法
        2.1.1 本章所用细胞系
        2.1.2 本章所用的抗体
        2.1.3 本章所用主要药品试剂
        2.1.4 本章用仪器设备
        2.1.5 本章所用质粒及构建
        2.1.6 shRNA的构建
        2.1.7 质粒转染
        2.1.8 siRNA的转染
        2.1.9 免疫杂交（Western blotting）
        2.1.10 融合蛋白GST-HOP的诱导表达
        2.1.11 免疫共沉淀
        2.1.12 GST-pulldown
        2.1.13 免疫荧光染色实验
        2.1.14 SRB检测细胞增殖
        2.1.15 AnnexinⅤ检测细胞凋亡
        2.1.16 细胞划痕愈合实验
        2.1.17 Transwell细胞迁移实验
        2.1.18 血管内皮细胞体外成管实验
        2.1.19 三维毛细血管出芽形成实验
        2.1.20 细胞极化实验
        2.1.21 活细胞膜皱褶实验
    第二节 本章实验结果
        2.2.1 HOP促进体外血管内皮细胞成管和毛细血管出芽
        2.2.2 敲减HOP不影响血管内皮细胞增殖或凋亡速率
        2.2.3 HOP对血管内皮细胞迁移很重要
        2.2.4 HOP调节迁移细胞极性和膜皱褶动态性
        2.2.5 HOP与微管共定位,并与微管蛋白相互作用
        2.2.6 胞外HOP不影响血管内皮细胞迁移或体外成管
第三章 谷胱甘肽化调控中性粒细胞的actin动态性
    第一节 材料与方法
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 培养和分化HL60细胞
        3.1.3 中性粒细胞分离
        3.1.4 细胞裂解和谷光甘肽化的免疫杂交
        3.1.5 EZ-taxiscan趋化实验
        3.1.6 分析细胞运动轨迹和形态
        3.1.7 HL60细胞系中野生型和突变型actin的表达
        3.1.8 细胞皱褶（极化）实验
        3.1.9 体外吞噬作用实验
        3.1.10 腹膜炎模型体内噬菌作用
        3.1.11 ¨中性粒细胞继承性移植
        3.1.12 Luminol化学发光法来测量ROS
        3.1.13 Wright-Giemsa染色
    第二节 本章实验结果
        3.2.1 ROS提升被刺激的中性粒细胞actin谷光甘肽化水平
        3.2.2 ROS和谷光甘肽化蛋白在趋化中的中性粒细胞的定位
        3.2.3 ROS的清除导致F-actin总量明显增高
        3.2.4 过表达Grx1对actin动态性和趋化的影响
        3.2.5 干扰Grx1修复清除ROS引起的中性粒细胞趋化缺陷
        3.2.6 Grx1是actin动态性的关键生理调节因子
        3.2.7 Grx1的敲除削弱腹膜炎鼠的中性粒细胞募集和杀菌能力
第四章 结论与展望
    第一节 HOP在细胞迁移中的作用
    第二节 谷光甘肽化修饰对actin动态性的调控
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果
    个人简历
    在学期间发表的学术论文

【共引文献】

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本文编号：2890440