人IL-15cDNA的克隆、表达及对HBsAg核酸疫苗的免疫佐剂作用

发布时间：2020-12-11 21:52

　　目的：以基因重组的方法构建人白细胞介素15（hIL-15）基因重组体，并在肝癌细胞BEL-7402中表达，为进一步研究IL-15的功能及临床应用奠定基础。同时将构建好的IL-15真核表达质粒与HBsAg核酸疫苗共同免疫Babl／c小鼠，以观察其对小鼠免疫应答的影响。 方法：依据Genbank中人白细胞介素15cDNA的序列，结合表达载体的特点，设计、合成一对IL-15基因序列特异性引物，从正常人外周血单个核细胞中抽提总RNA作模板，通过RT-PCR扩增得到人成熟IL-15的cDNA片段，然后将IL-15cDNA克隆入pGEM-T Easy Vector中，形成中介重组体PGEM-IL-15，经酶切鉴定和测序分析后，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1hisB上，构建人IL-15的真核表达载体pcDNA3.1hisB-IL-15。通过脂质体法转染至BEL-7402细胞，G418加压筛选，建立真核表达细胞株，ELISA法检测细胞培养上清IL-15蛋白含量，用IL-15依赖细胞株CTLL-2细胞及MTT法检测rhIL-15生物学活性。 同时，单以HBsAg核酸疫苗pcDNA3.... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

RT一PCR产物的琼脂糖凝胶电泳lanel:RT一PCR产物ane:mars

示其中3个菌落有目的片段的插入。电泳结果显示两条清晰的带型，大分子量片段为载体DNA，小分子量片段与待插入片段的大小一致，见图5。以上述质粒作模板进行PCR，均显示有500bp大小的扩增条带，挑取经酶切鉴定的重组克隆进行序列测定，测序结果与己报道序列进行比较，证实两者序列一致。见图6。提示中介重组体pGEM一IL一15的构建成功。

落进行扩增，菌落PCR有3个可以看见约500bp大小的扩增条带，该细菌抽提质粒DNA后，BamHI及EcoRI双酶切释放出500bP的小片断，电泳结果见图7。

【参考文献】：
期刊论文
[1]PCR简便快速筛选阳性克隆[J]. 王安,赵明,丁广治.  生物技术通讯. 2000(01)
[2]支气管哮喘病人外周血单核/巨噬细胞IL-15的分泌水平[J]. 吕冬梅,黄瑾,吕春平.  中国病理生理杂志. 1999(07)



本文编号：2911264