EV713D聚合酶基因体外重组质粒的构建、表达及活性检测
发布时间：2020-12-14 16:41
目的构建编码肠道病毒71型（EV71）3D聚合酶基因的重组质粒,表达和纯化3D聚合酶并检测其活性。方法将编码3D聚合酶的基因片段克隆至pGEX-4T-1原核表达载体,重组质粒转化入大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析、TEV酶酶切、Ni-NTA柱亲和纯化后获得高纯度3D聚合酶蛋白,放射测量法是体外酶活力测定方法中较常见的一种方法,本研究通过测定插入poly（U） RNA放射性标志UMP的量确定3D聚合酶的活性。结果经酶切、PCR、测序鉴定pGEX-4T-3D重组质粒构建成功,3D聚合酶基因片段大小为1 386 bp。与未诱导相比,经IPTG诱导后带有GST标签的3D聚合酶成功表达,表达产物的相对分子质量约为79×103,TEV酶酶切掉GST标签后的相对分子质量约为55×103。纯化的3D聚合酶经体外延伸反应后跑变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳得知,3D聚合酶溶解液DMSO组相比于3D聚合酶强抑制剂EDTA组,在DMSO组中,可以观察到强电泳条带,表明放射性同位素标志程度强,表明反应速率快,即3D聚合酶酶活较好。结...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019年09期 北大核心
【文章页数】：5 页
【图文】：
图１３Ｄ聚合酶基因ＰＣＲ扩增１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）２３Ｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｇｅｎｅ１ＤＮＡ标志物（ＤＬ２０００）
１００００ｇ离心３０ｍｉｎ后取上清液，经１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定，３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中成功表达，其相对分子质量为７９×１０３（图３）。３３Ｄ聚合酶的纯化３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中可溶性表达，主要存在于裂解液上清。重组菌裂解液经柱层析纯化后得到纯度较高的带有ＧＳＴ标签的３Ｄ蛋白，其相对分子质量为７９×１０３左右（图４）。１ＤＮＡ标志物２ｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ双酶切图２重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３Ｄ酶切鉴定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２Ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ蛋白分子质量标准１重组菌ＩＰＴＧ诱导表达产物２重组菌未诱导对照图３重组３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中的表达鉴定ＭＭａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１ＩｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ２ＵｎｉｎｄｕｃｅｄＦｉｇ．３ＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｎｇ３ＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＬ２１１蛋白分子质量标准２重组菌未诱导３重组菌ＩＰＴＧ诱导菌体４重组菌ＩＰＴＧ诱导后破碎上清５重组菌ＩＰＴＧ诱导后破碎沉淀６过柱收集液７ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第１次收集液８ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第２次收集液９ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第３次收集液１０ＴＥＶ酶切后收集液图
７９×１０３左右（图４）。１ＤＮＡ标志物２ｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ双酶切图２重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３Ｄ酶切鉴定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２Ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ蛋白分子质量标准１重组菌ＩＰＴＧ诱导表达产物２重组菌未诱导对照图３重组３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中的表达鉴定ＭＭａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１ＩｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ２ＵｎｉｎｄｕｃｅｄＦｉｇ．３ＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｎｇ３ＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＬ２１１蛋白分子质量标准２重组菌未诱导３重组菌ＩＰＴＧ诱导菌体４重组菌ＩＰＴＧ诱导后破碎上清５重组菌ＩＰＴＧ诱导后破碎沉淀６过柱收集液７ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第１次收集液８ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第２次收集液９ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第３次收集液１０ＴＥＶ酶切后收集液图４１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析纯化带ＧＳＴ标签３Ｄ聚合酶１Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）２Ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ３ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｄｕｃｅｄｗｉｈＩＰＴＧ４ＴｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ５Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ６Ｔｈｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｂｉｎｄｉｎｇｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈｃｏｌｕｍｎ７Ｔｈｅｆｉｒ
【参考文献】：
期刊论文
[1]肠道病毒71型3D聚合酶转录激活域的界定[J]. 徐骁,姚云芳,李靖,柴克莉,乔文涛,谈娟. 病毒学报. 2016(05)
[2]线粒体自噬受体Bnip3的载体构建及蛋白表达纯化[J]. 张玲莉,张星亮. 生物技术. 2015(04)
[3]蛋白激酶的生化活性检测方法研究进展[J]. 李玥,李会娟,高芳,王田,毛伟峰. 生命的化学. 2014(05)
[4]沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化[J]. 安贤惠,周秀芬,汪志军,邓子新,梁晶丹. 微生物学报. 2013(10)
[5]放射性同位素标记法检测脂蛋白脂肪酶活性及其应用[J]. 张爱宏,刘国庆. 中国动脉硬化杂志. 2003(06)
[6]放射性同位素标记测定RNA N-糖苷酶活性的新方法[J]. 王喜萍,刘望夷,王鸣歧. 生物化学与生物物理进展. 1990(06)
硕士论文
[1]肿瘤抑制蛋白APC与Amer1的结合机理研究[D]. 肖亚飞.上海交通大学 2014
本文编号：2916675
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019年09期 北大核心
【文章页数】：5 页
【图文】：
图１３Ｄ聚合酶基因ＰＣＲ扩增１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）２３Ｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｇｅｎｅ１ＤＮＡ标志物（ＤＬ２０００）
１００００ｇ离心３０ｍｉｎ后取上清液，经１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定，３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中成功表达，其相对分子质量为７９×１０３（图３）。３３Ｄ聚合酶的纯化３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中可溶性表达，主要存在于裂解液上清。重组菌裂解液经柱层析纯化后得到纯度较高的带有ＧＳＴ标签的３Ｄ蛋白，其相对分子质量为７９×１０３左右（图４）。１ＤＮＡ标志物２ｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ双酶切图２重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３Ｄ酶切鉴定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２Ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ蛋白分子质量标准１重组菌ＩＰＴＧ诱导表达产物２重组菌未诱导对照图３重组３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中的表达鉴定ＭＭａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１ＩｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ２ＵｎｉｎｄｕｃｅｄＦｉｇ．３ＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｎｇ３ＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＬ２１１蛋白分子质量标准２重组菌未诱导３重组菌ＩＰＴＧ诱导菌体４重组菌ＩＰＴＧ诱导后破碎上清５重组菌ＩＰＴＧ诱导后破碎沉淀６过柱收集液７ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第１次收集液８ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第２次收集液９ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第３次收集液１０ＴＥＶ酶切后收集液图
７９×１０３左右（图４）。１ＤＮＡ标志物２ｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ双酶切图２重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－３Ｄ酶切鉴定１ＤＮＡｍａｒｋｅｒ２Ｄｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠＦｉｇ．２ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＧＥＸ－４Ｔ－３ＤｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｕａｌ－ｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＭ蛋白分子质量标准１重组菌ＩＰＴＧ诱导表达产物２重组菌未诱导对照图３重组３Ｄ聚合酶在ＢＬ２１中的表达鉴定ＭＭａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１ＩｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ２ＵｎｉｎｄｕｃｅｄＦｉｇ．３ＩＰＴＧｉｎｄｕｃｉｎｇ３ＤｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＬ２１１蛋白分子质量标准２重组菌未诱导３重组菌ＩＰＴＧ诱导菌体４重组菌ＩＰＴＧ诱导后破碎上清５重组菌ＩＰＴＧ诱导后破碎沉淀６过柱收集液７ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第１次收集液８ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第２次收集液９ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ冲洗第３次收集液１０ＴＥＶ酶切后收集液图４１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析纯化带ＧＳＴ标签３Ｄ聚合酶１Ｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）２Ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ３ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｄｕｃｅｄｗｉｈＩＰＴＧ４ＴｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｃｅｌｌｌｙｓａｔｅｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ５Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ６Ｔｈｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｂｉｎｄｉｎｇｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈｃｏｌｕｍｎ７Ｔｈｅｆｉｒ
【参考文献】：
期刊论文
[1]肠道病毒71型3D聚合酶转录激活域的界定[J]. 徐骁,姚云芳,李靖,柴克莉,乔文涛,谈娟. 病毒学报. 2016(05)
[2]线粒体自噬受体Bnip3的载体构建及蛋白表达纯化[J]. 张玲莉,张星亮. 生物技术. 2015(04)
[3]蛋白激酶的生化活性检测方法研究进展[J]. 李玥,李会娟,高芳,王田,毛伟峰. 生命的化学. 2014(05)
[4]沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化[J]. 安贤惠,周秀芬,汪志军,邓子新,梁晶丹. 微生物学报. 2013(10)
[5]放射性同位素标记法检测脂蛋白脂肪酶活性及其应用[J]. 张爱宏,刘国庆. 中国动脉硬化杂志. 2003(06)
[6]放射性同位素标记测定RNA N-糖苷酶活性的新方法[J]. 王喜萍,刘望夷,王鸣歧. 生物化学与生物物理进展. 1990(06)
硕士论文
[1]肿瘤抑制蛋白APC与Amer1的结合机理研究[D]. 肖亚飞.上海交通大学 2014
本文编号：2916675
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shiyanyixue/2916675.html
最近更新
教材专著
