鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白的基因密码子优化及异源表达纯化

发布时间：2020-12-15 08:07

　　目的优化鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白基因密码子并在大肠埃希菌中进行异源表达纯化。方法依据大肠埃希菌密码子偏好性对鼠疫耶尔森菌YopJ基因进行全基因序列优化,并设计引物。分别以密码子优化前后的鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白的基因为模板,将包含YopJ（22aa-288aa）和YopJ（22aa-250aa）的基因片段连接到载体pGI01中。重组质粒转化到大肠埃希菌BL21菌株中,扩大培养后,IPTG诱导目的蛋白表达。提取大肠埃希菌表达蛋白并使用镍离子柱进行纯化。结果鼠疫耶尔森菌YopJ密码子优化前YopJ（22aa-288aa）及YopJ（22aa-250aa）在大肠埃希菌内表达水平较低,密码子优化后YopJ（22aa-288aa）及YopJ（22aa-250aa）在大肠埃希菌内大量表达可溶性YopJ蛋白。结论对鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白进行基因密码子优化能够提高其在大肠埃希菌内的表达量。获得的鼠疫耶尔森菌YopJ蛋白具有可溶性,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。 

【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019年09期 北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

图１密码子优化前鼠疫耶尔森菌ＹｏｐＪＤＮＡ序列Ｆｉｇ．１ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＹｅｒｓｉｎｉａＹｏｐＪｂｅｆｏｒｅｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

ｆ、ｗ、ｅ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测。结果１密码子优化前后鼠疫耶尔森菌ＹｏｐＪ基因序列比较密码子优化前后鼠疫耶尔森菌ＹｏｐＪ基因序列见图１和图２。根据大肠杆菌的密码子偏好性，对ＹｏｐＪ的ＤＮＡ序列进行优化，保持氨基酸的序列不变，替换了１７４个碱基。图１密码子优化前鼠疫耶尔森菌ＹｏｐＪＤＮＡ序列Ｆｉｇ．１ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＹｅｒｓｉｎｉａＹｏｐＪｂｅｆｏｒｅｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ图２密码子优化后鼠疫耶尔森菌ＹｏｐＪＤＮＡ序列Ｆｉｇ．２ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＹｅｒｓｉｎｉａＹｏｐＪａｆｔｅｒｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ２目的基因的鉴定用密码子优化前后各两组引物分别将鼠疫耶尔森菌ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａ基因及ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因进行扩增，将ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小分别８０１ｂｐ和６８７ｂｐ（图３）。３重组蛋白的鉴定将含有重组质粒的表达菌分别接种到ＬＢ培养基中进行扩大培养，当Ａ６００值为０．６～０．８时，１６℃降温１ｈ，加入ＩＰＴＧ低温诱导过夜，离心收集菌，破碎，离心得到可溶蛋白，经镍离子亲和层析柱纯化后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，ＹｏｐＪ蛋白相对分子质量约为３２×１０３。其中密码子优化前ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａ基因无可溶性ＹｏｐＪ蛋白表达，ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因表达可溶性ＹｏｐＪ蛋白的量较少（图４）。密码子优化后两组基因可溶性

ＹｏｐＪ蛋白表达，ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因表达可溶性ＹｏｐＪ蛋白的量较少（图４）。密码子优化后两组基因可溶性ＹｏｐＪ蛋白表达水平较密码子优化前有显著提升（图５）。ＭＤＮＡ标志物（ＤＬ２００）１优化前ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａ基因ＰＣＲ产物２优化前ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因ＰＣＲ产物３优化后ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａ基因ＰＣＲ产物４优化后ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａ基因ＰＣＲ产物图３ＰＣＲ扩增目的基因片段ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａｇｅｎｅｂｅｆｏｒｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ２ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａｇｅｎｅｂｅｆｏｒｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ３ＹｏｐＪ２２ａａ－２８８ａａｇｅｎｅａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ４ＹｏｐＪ２２ａａ－２５０ａａｇｅｎｅａｆｔｅｒｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＦｉｇ．３ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ·６０１０·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年９月第１４卷第９期Ｓｅｐ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．９


本文编号：2917954