恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表达和分析

发布时间：2017-04-08 04:06

  本文关键词：恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2的表达和分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分麦胚无细胞蛋白合成系统表达恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白 目的：采用麦胚无细胞蛋白合成系统表达具有生物活性的恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL1和MSPDBL2。 方法：恶性疟原虫实验室培养标准株3D7提取的基因组DNA为模板，采用In-Fusion克隆技术快速连接目的片段和质粒载体pEU-His。转化大肠杆菌DH5α株，获得含有目的基因的表达质粒。通过双酶切和DNA测序分析鉴定重组质粒。中提重组质粒后，用麦胚无细胞蛋白合成系统进行表达，对表达产物进行纯化和分析。 结果：PCR成功扩增6个目的基因片段，MSPDBL1（2043bp），MSPDBL2（2200bp），DBL1（933bp），DBL2（921bp），SPAM1（465bp），SAPM2（576bp），，并成功构建了6个用于麦胚无细胞蛋白合成系统的重组质粒，该6个重组质粒在麦胚无细胞蛋白合成系统中成功地表达出了6个重组恶性疟原虫蛋白rMSPDBL1（Mr74kDa），rMSPDBL2（Mr84kDa），rDBL1（Mr34kDa），rDBL2（Mr34kDa），rSPAM1（Mr17kDa），rSAPM2（Mr21kDa），经western blotting鉴定，表达产物的可溶性为100%，并成功纯化出重组蛋rSPAM1。 结论：麦胚无细胞蛋白合成系统可以提高重组蛋白的可溶性。关于麦胚无细胞蛋白合成系统表达的重组蛋白质的纯化问题，需要进一步的研究。 第二部分恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL2-DBL2结构域的原核表达和抗原性分析 目的：克隆、表达恶性疟原虫疫苗候选分子裂殖子表膜蛋白MSPDBL2（PF10_0355）的DBL2结构域，并研究其抗原性。 方法：提取恶性疟原虫实验室培养标准株3D7的基因组DNA为模板进行PCR扩增，采用In-Fusion克隆技术快速连接目的片段和质粒载体，构建重组表达质粒pET28a-DBL2，转化大肠埃希菌BL2l（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并经亲和层析获得纯化的重组蛋白rDBL2。分别以恶性疟病人血清、正常人血清、对照混合血清作为一抗，蛋白质印迹（western blotting）分析该重组蛋白的抗原性。 结果：PCR扩增获得长约950bp片段，菌落PCR和测序结果显示，重组质粒pET28a-DBL2构建成功，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示，经IPTG诱导并经亲和层析纯化后获得相对分子质量（Mr）约为34kDa的包涵体蛋白。经变性条件纯化得到rDBL2，western blotting分析结果显示，该重组表达蛋白rDBL2被恶性疟病人血清识别，有较好的抗原性。 结论：成功克隆和表达纯化了恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白MSPDBL2的DBL2结构域，重组蛋白rDBL2有良好的抗原性。 第三部分中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性分析 目的：探讨中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因多态性特点。 方法：中缅边境恶性疟病人血滤纸片提取恶性疟原虫基因组DNA，根据恶性疟原虫基因Pfmspdbl2（PF10_0355）为目的扩增片段设计特异性引物，进行聚合酶链反应（PCR）扩增，以恶性疟原虫标准株3D7作为参照，利对所获得的基因序列进行测序分析，评估序列多态性。 结果：80份恶性疟原虫基因组DNA，PCR扩增并测序成功16个Pfmspdbl2基因片段。测序结果显示，Pfmspdbl2基因16样本中，野生型占87.5%（14/16），突变型占12.5%（2/16）。 结论：中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2基因具有多态性。中缅边境恶性疟原虫Pfmspdbl2有阳性选择趋势，可能与人的抗虫免疫的有关。
【关键词】：恶性疟原虫 裂殖子表膜蛋白 麦胚无细胞蛋白合成系统 恶性疟原虫 裂殖子 原核表达 抗原性 恶性疟原虫 裂殖子表膜蛋白 多态性
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R382.31
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 引言11-14
• 第一部分 麦胚无细胞蛋白合成系统表达恶性疟原虫裂殖子表膜蛋白 MSPDBL1和 MSPDBL2414-34
• 1. 材料与方法14-27
• 2. 结果27-31
• 3. 讨论31-34
• 第二部分 恶性疟原虫 MSPDBL2-DBL2 结构域的原核表达和抗原性分析34-44
• 1. 材料和方法34-38
• 2. 结果38-41
• 3. 讨论41-44
• 第三部分 中缅边境恶性疟原虫 PFMSPDBL2 基因多态性分析44-50
• 1. 材料和方法44-46
• 2. 结果46-48
• 3. 讨论48-50
• 小结50-52
• 参考文献52-58
• 综述58-67
• 1. 疟原虫入侵红细胞和红细胞黏附的相关过程59
• 2. 恶性疟原虫中的 DBL（Duffy binding-like）结构域超家族59-62
• 3. 展望62-63
• 参考文献63-67
• 英文缩略词表67-68
• 硕士在读期间研究成果68-69
• 致谢69-70

【共引文献】

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本文编号：292018