RasGRP3和Ca 2+ 调控TLRs触发的天然免疫应答及其机制研究
发布时间：2020-12-19 02:04
天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的一道有力屏障。功能正常的天然免疫能使机体长期维持在比较健康的状态,而功能失调的天然免疫,则容易导致各种疾病的发生。免疫调节对维持正常的天然免疫功能至关重要。近年来,关于天然免疫的调节一直都是研究人员感兴趣的研究领域。TLRs是天然免疫细胞上表达的一类主要的模式识别受体,对TLRs信号通路的深入研究将有助于我们对天然免疫调节的全面认识。本课题主要是在巨噬细胞中探讨RasGRP3和Ca2+对TLRs触发的免疫应答强度的调节。第一部分RasGRP3负调巨噬细胞中TLRs触发的IL-6的产生及其分子机制研究天然免疫在宿主抗感染免疫过程中发挥着不可替代的作用。当有病原微生物入侵机体时,天然免疫细胞会第一时间检测到病原微生物入侵并启动抗感染免疫应答。在我们的日常生活中,病原微生物无处不在,我们的皮肤、粘膜等组织时刻都会和病原微生物发生接触,然而在我们体内,天然免疫细胞并不会每时每刻都对它们所监测到的病原微生物启动抗感染免疫应答。在长期进化过程中,天然免疫细胞形成了一套非常完善的启动免疫应答的准入标准：当监测到的病原微生物信号非常微弱时,天然免疫细胞不会产生应答；只...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
4模式图显示SOS和RasGRP根据刺激物浓度介导细胞应答的强度Figure1.3.4ModeofSOSandRasGRPmediatedstrengthofcellresponseaccording
用较低浓度的LPS、Poly (I:C)或CpG ODN刺激巨唾细胞时，其他细胞因子也均有一定程度的增加，如TOF-ct、IL-ip和iNOS等（如图1.3.5a-c),只是3 DCtrl siRNA b DCtrl siRNA C DCtrl siRNA■ RasGRP3 siRNA ■ RasGRP3 siRNA ■ RasGRPS siRNA9" 200 iTNFa *** ^ 2001/1-1/3 互 150 飞iNOSh I . |i5。l ni M II 100 门■门■ I 100 I I 1 鬥| iI 50 [l|n| I I 5ol |n|n| I 叫门Ifll nsI LIfll I I oLI^JniMed LPS (l;C) CpG Med LPS (l:C)CpG Med LPS(l;C)CpG图1.3.5在巨嗟细胞中敲低RasGRP3的表达促进TNF-ot以及iNOS的产生Figure 1.3.5 Knockdown of RasGRP3 promotes TNFa, IL-ip and iNOSexpression in macrophages. Peritoneal macrophages were transiently transfected withcontrol (Ctrl) or RasGRPS-specific siRNAs for 48h. Cells were treated with 1 ng/mlLPS, 2.5 [xg/ml Poly (I:C) or 6 |ig/ml CpG ODN for 6h. Then mRNA levels of TNFa(a), IL-ip (b) and iNOS (c) were determined by Q-PCR. Data are representative ofthree technical repeats with mean士s.d. ns, not significant; *, P < 0.05; **，P < 0.01;***，尸 <0.001 (ANOVA).RasGRP3对这些细胞因子的影响没有RasGRP3对IL-6的影响那么显著。从而表明在较低浓度的刺激物作用下，RasGRP3主要能抑制巨嗟细胞中IL-6的产生。由于我们平时在实验过程中所使用的刺激物的浓度(如100 ng/ml LPS)远高于正常生理条件下机体细胞所能接触到的病原微生物的浓度
Poly (I:C)或CpG ODN作用下，过表达RasGRP3分子能显著抑制巨嗟细胞系RAW264.7细胞系中IL-6的表达(如图1.3.7b，c)。进一步表明RasGRP3确实能在低浓度刺激物作用下负调TLRs触发的IL-6的产生。3 b DMock C OMock■ RasGRPS _RasGRP3(5r\i *?*■* *** *** AC\C\^ *** *** ***w I' I f 1 { I jii I 1J 1*1 n2 < .n f 300ct 2 40 Eo ^ 1 广] a 200 [-]o TO ^ 一tr g> 20 ^！B: Flag I i 门 -^00 Bp' ‘ Med LPS (l:C)CpG Med LPS (l:C)CpG图1.3.7在巨唾细胞中过表达RasGRP3能抑制IL-6的产生Figure 1.3.7 RasGRPS inhibits IL-6 production in macrophages, (a-c) RAW264.7cells stably transfected with Flag-tagged RasGRP3 were examined for RasGRPSexpression by Western blot (a)，or treated with or without 1 ng/ml LPS, 2,5 jxg/ml Poly(I:C) or 6 |ig/ml CpG ODN for 6h (b，c). Then IL-6 mRNA levels and the IL-6 proteinswere examined by Q-PCR (b) and ELISA (c) respectively. Data in (b，c) arerepresentative of three technical repeats with mean士s.d. ns, ***，P < 0.001 (ANOVA).3.4 RasGRP3分子的活化依赖于PKC对RasGRP3第155位苏氨酸的碟酸化以往的研究表明在B细胞中，BCR/Ras信号通路的活化依赖于PKC对RasGRP3第155位苏氨酸的礎酸化[37，38]。所以我们就想看看在巨唾细胞中
本文编号：2925044
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
4模式图显示SOS和RasGRP根据刺激物浓度介导细胞应答的强度Figure1.3.4ModeofSOSandRasGRPmediatedstrengthofcellresponseaccording
用较低浓度的LPS、Poly (I:C)或CpG ODN刺激巨唾细胞时，其他细胞因子也均有一定程度的增加，如TOF-ct、IL-ip和iNOS等（如图1.3.5a-c),只是3 DCtrl siRNA b DCtrl siRNA C DCtrl siRNA■ RasGRP3 siRNA ■ RasGRP3 siRNA ■ RasGRPS siRNA9" 200 iTNFa *** ^ 2001/1-1/3 互 150 飞iNOSh I . |i5。l ni M II 100 门■门■ I 100 I I 1 鬥| iI 50 [l|n| I I 5ol |n|n| I 叫门Ifll nsI LIfll I I oLI^JniMed LPS (l;C) CpG Med LPS (l:C)CpG Med LPS(l;C)CpG图1.3.5在巨嗟细胞中敲低RasGRP3的表达促进TNF-ot以及iNOS的产生Figure 1.3.5 Knockdown of RasGRP3 promotes TNFa, IL-ip and iNOSexpression in macrophages. Peritoneal macrophages were transiently transfected withcontrol (Ctrl) or RasGRPS-specific siRNAs for 48h. Cells were treated with 1 ng/mlLPS, 2.5 [xg/ml Poly (I:C) or 6 |ig/ml CpG ODN for 6h. Then mRNA levels of TNFa(a), IL-ip (b) and iNOS (c) were determined by Q-PCR. Data are representative ofthree technical repeats with mean士s.d. ns, not significant; *, P < 0.05; **，P < 0.01;***，尸 <0.001 (ANOVA).RasGRP3对这些细胞因子的影响没有RasGRP3对IL-6的影响那么显著。从而表明在较低浓度的刺激物作用下，RasGRP3主要能抑制巨嗟细胞中IL-6的产生。由于我们平时在实验过程中所使用的刺激物的浓度(如100 ng/ml LPS)远高于正常生理条件下机体细胞所能接触到的病原微生物的浓度
Poly (I:C)或CpG ODN作用下，过表达RasGRP3分子能显著抑制巨嗟细胞系RAW264.7细胞系中IL-6的表达(如图1.3.7b，c)。进一步表明RasGRP3确实能在低浓度刺激物作用下负调TLRs触发的IL-6的产生。3 b DMock C OMock■ RasGRPS _RasGRP3(5r\i *?*■* *** *** AC\C\^ *** *** ***w I' I f 1 { I jii I 1J 1*1 n2 < .n f 300ct 2 40 Eo ^ 1 广] a 200 [-]o TO ^ 一tr g> 20 ^！B: Flag I i 门 -^00 Bp' ‘ Med LPS (l:C)CpG Med LPS (l:C)CpG图1.3.7在巨唾细胞中过表达RasGRP3能抑制IL-6的产生Figure 1.3.7 RasGRPS inhibits IL-6 production in macrophages, (a-c) RAW264.7cells stably transfected with Flag-tagged RasGRP3 were examined for RasGRPSexpression by Western blot (a)，or treated with or without 1 ng/ml LPS, 2,5 jxg/ml Poly(I:C) or 6 |ig/ml CpG ODN for 6h (b，c). Then IL-6 mRNA levels and the IL-6 proteinswere examined by Q-PCR (b) and ELISA (c) respectively. Data in (b，c) arerepresentative of three technical repeats with mean士s.d. ns, ***，P < 0.001 (ANOVA).3.4 RasGRP3分子的活化依赖于PKC对RasGRP3第155位苏氨酸的碟酸化以往的研究表明在B细胞中，BCR/Ras信号通路的活化依赖于PKC对RasGRP3第155位苏氨酸的礎酸化[37，38]。所以我们就想看看在巨唾细胞中
本文编号：2925044
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