mTOR和AMPK信号通路在谷氨酰胺调控猪肠上皮细胞生长中的作用研究
发布时间：2017-04-10 23:14
本文关键词：mTOR和AMPK信号通路在谷氨酰胺调控猪肠上皮细胞生长中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：本研究比较了不同水平的谷氨酰胺（L-glutamine，Gln）对肠上皮细胞生长和活力的影响，并探讨mTOR与AMPK信号通路在Gln调控肠上皮细胞生长中的作用。 1．几种氨基酸及其衍生物对肠上皮细胞生长的作用 研究L-谷氨酰胺(L-glutamine， Gln)， Nα-乙酰-L-谷氨酰胺（Nα-acetyl-L-glutamine，NAG），L-精氨酸（L-arginine，，ARG），N-α-乙酰-L-精氨酸（N-alpha-acetyl-L-arginine，NAA）、瓜氨酸（L-citrulline，CIT），α-酮戊二酸（Alpha-ketoglutaric acid，AKG）和L-脯氨酸（L-Proline，PRO）对猪小肠上皮细胞（Intestinal porcine epithelial cells，IPEC-1）细胞活力与生长的影响。在IPEC-1定制培养液中分别添加不同浓度的氨基酸或其衍生物培养4天，用CCK8（cell counting kit8）法检测细胞的活力，并用细胞计数法检测这些氨基酸或其衍生物对细胞生长的影响。结果显示：试验的整个四天，Gln组IPEC-1细胞的数量（P0.05）和OD值（P0.05）均显著高于其他组。在试验的第4天，NAG、AKG、CIT、NAA和ARG组细胞数量均高于对照组（P0.05）。培养液中添加PRO对IPEC-1细胞的生长无明显影响。 2．不同水平Gln对IPEC细胞生长的影响 为比较不同浓度Gln对细胞生长的影响，选出最适IPEC-1细胞生长的Gln水平，在IPEC-1定制培养液中分别添加不同水平的Gln（0，0.2，0.5，1，2，5mM）培养4天，用CCK8法检测细胞的活力，并用细胞计数法检测不同水平Gln对细胞数量的影响。结果表明：与其它Gln水平相比，2mM Gln组IPEC-1细胞数量最多且细胞的OD值最大。后三天，细胞生长数量与Gln（0-2mM）呈剂量-效应依赖性。 3．Gln对IPEC-1细胞相关基因表达量的影响 为阐明Gln促进肠上皮细胞生长的分子机理，在IPEC-1定制培养液中添加不同水平Gln（0，0.5，1，2，5mM）培养3天，实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测细胞mTOR和AMPK信号通路关键分子生长与生理、线粒体功能等相关分子mRNA表达量的影响。结果显示：2mM Gln上调了4EBP1、CFTR、SGLT-1、Na+/K+-ATPase、ZO-1、HSP70、COX7C和Bax mRNA的相对表达量（P0.05），但是下调了Akt、Bcl-2、IGFBP3和Sirt1mRNA相对表达量（P0.05）。 4．mTOR信号通路在Gln调控IPEC-1细胞生长中的作用 首先选用mTOR的抑制剂雷帕霉素（rapamycin，RAP）进行研究，结果发现RAP对IPEC-1细胞生长有抑制作用，且其对IPEC-1细胞的最适抑制浓度和处理时间分别为10nM和3d。然后采用2×2因子设计试验研究mTOR信号通路在Gln调控IPEC-1细胞生长中的作用。试验分为4个组：（1）0mM Gln，无RAP处理；（2）2mM Gln，无RAP处理；（3）0mM Gln，RAP处理；（4）2mM Gln，RAP处理。在IPEC-1定制培养液中分别添加相应浓度的Gln和RAP培养3天，RT-PCR检测Gln对RAP处理IPEC-1细胞mTOR和AMPK信号通路生长与生理、线粒体功能等相关分子mRNA的影响，Western Blot检测Gln对RAP处理IPEC-1细胞mTOR和AMPK信号通路关键分子蛋白表达的影响。结果显示：（1）试验第3和4天，Gln可缓解RAP对细胞增殖的抑制作用；（2）添加Gln上调了IPEC-1细胞AMPKS6K14EBP1ASCT2BaxCFTRSGLT-1ZO-1ODCeIF2B和COX7C mRNA的相对表达量（P0.05），降低了AkteIF2α和MAPK6mRNA的相对表达量（P0.05）；（3）RAP处理使AMPKmTORS6K14EBP1ASCT2SGLT-1HSP70ZO-1ODCeIF2BBcl-xlBcl-2COX7C和Sirt1mRNA表达量增加（P0.05），但下调了eIF2αMAPK6和CFTR mRNA相对表达量（P0.05）；（4）与GAP组相比，Gln+RAP组细胞4EBP1、HSP70、ZO-1、Bcl-xl、eIF2B和Sirt1mRNA的相对表达量降低（P0.05）；（5）RAP处理抑制了细胞mTOR和S6K1的磷酸化，并降低p-S6K1/S6K1比值（P0.05）。 5．AMPK信号通路在Gln调控IPEC-1细胞生长中的作用 首先选用AMPK的抑制剂P5499对细胞进行处理，研究发现P5499对IPEC-1细胞生长有抑制作用，且其对IPEC-1细胞的最适抑制浓度和处理时间分别为1μM和3d。然后设计2×2因子试验探究AMPK信号通路在Gln调控IPEC-1细胞生长中的作用。试验分为4个组：（1）0nM Gln，无P5499处理；（2）2mMGln，无P5499处理；（3）0nM Gln，P5499处理；（4）2mM Gln，P5499处理。在IPEC-1定制培养液中添加相应的Gln和P5499培养3天，RT-PCR检测培养基中添加Gln对P5499处理IPEC-1细胞mTOR和AMPK信号通路生长与生理及线粒体功能相关分子mRNA的影响，Western Blot检测添加Gln对P5499处理IPEC-1细胞mTOR和AMPK信号通路关键分子蛋白表达的影响。结果显示：（1）Gln缓解了P5499对细胞活力的抑制作用和第三天对细胞增殖的抑制作用；（2）Gln降低了Akt和Sirt1mRNA的相对表达量，但是提高了mTORS6K14EBP1CFTRSGLT-1HSP70ZO-1ASCT2ODCBaxBcl-2eIF2B和COX7C mRNA的表达量（P0.05）；（3）P5499处理上调了AktAMPKASCT2和eIF2B mRNA表达（P0.05），但是降低了Bcl-2SGLT-1HSP70和Bcl-xl mRNA表达量（P0.05）；（4）与P5499组相比，Gln+P5499组细胞的AMPKCFTRSGLT-1和ZO-1mRNA的相对表达量降低；（5）2mMGln提高了AMPK蛋白的相对表达量（P0.05）；（6）P5499处理提高了AMPK蛋白的相对表达量，但是下调了p-mTOR蛋白表达（P0.05）。 总之，本试验研究表明，IPEC-1细胞培养液中Gln的最适添加水平为2mM。2mM Gln提高了IPEC-1细胞的4EBP1、CFTR、SGLT-1、Na+K+-ATPase、ZO-1、HSP70、COX7C等基因的相对表达量，下调了Akt、Bcl-2、IGFBP3、Sirt1等基因的表达量。Gln调控IPEC-1的细胞生长可能与mTOR信号通路分子4EBP1基因表达、S6K1蛋白表达和AMPK信号通路分子AMPK蛋白表达有关。
【关键词】：谷氨酰胺 肠上皮细胞 mTOR信号通路 AMPK信号通路
【学位授予单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：
- 摘要5-8
- ABSTRACT8-16
- 缩写词16-18
- 第一章 绪论18-32
- 1.1 国内外研究现状18-30
- 1.1.1 谷氨酰胺的理化性质18
- 1.1.2 谷氨酰胺对肠道组织和肠上皮细胞的作用18-19
- 1.1.3 mTOR 信号通路研究进展19-24
- 1.1.4 AMPK 信号通路研究进展24-30
- 1.2 研究的目的与意义30-31
- 1.3 研究内容31-32
- 第二章 试验研究32-98
- 试验一 几种氨基酸及其衍生物对 IPEC-1 细胞生长的影响32-42
- 1.1 材料与方法33-37
- 1.1.1 试验材料与试剂33
- 1.1.2 培养基配方33-35
- 1.1.3 试验分组35-36
- 1.1.4 细胞培养36
- 1.1.5 测定指标与方法36
- 1.1.6 数据处理36-37
- 1.2 结果37-39
- 1.2.1 NAG 和 Gln 对 IPEC-1 细胞生长的影响37
- 1.2.2 ARG、NAA、CIT 和 AKG 对 IPEC-1 细胞生长的影响37-38
- 1.2.3 PRO 对 IPEC-1 细胞生长的影响38-39
- 1.3 讨论39-41
- 1.3.1 Gln 和 NAG 对 IPEC-1 细胞活力与生长的影响39
- 1.3.2 AKG 对 IPEC-1 细胞活力与生长的影响39-40
- 1.3.3 ARG 和 NAA 对 IPEC-1 细胞活力与生长的影响40
- 1.3.4 CIT 对 IPEC-1 细胞活力与生长的影响40-41
- 1.3.5 PRO 对 IPEC-1 细胞生长的影响41
- 1.4 小结41-42
- 试验二 不同水平 Gln 对 IPEC 细胞生长的影响42-46
- 2.1 材料和方法42-43
- 2.1.1 试验材料与试剂42
- 2.1.2 培养基配方42
- 2.1.3 试验分组42-43
- 2.1.4 细胞培养43
- 2.1.5 测定指标与方法43
- 2.1.6 数据处理43
- 2.2 试验结果43-44
- 2.2.1 不同水平 Gln 对细胞活力的影响43-44
- 2.2.2 不同水平 Gln 对细胞数量的影响44
- 2.3 讨论44-45
- 2.4 小结45-46
- 试验三 Gln 对 IPEC-1 细胞相关基因 mRNA 表达的影响46-61
- 3.1 材料与方法46-50
- 3.1.1 试验材料与方法46
- 3.1.2 培养基配方46
- 3.1.3 试验分组46-47
- 3.1.4 细胞培养47
- 3.1.5 测定指标与方法47-50
- 3.1.6 数据分析50
- 3.2 试验结果50-53
- 3.2.1 Gln 对 EGFR、mTOR 和 AMPK 信号通路关键分子的基因表达量的影响50-51
- 3.2.2 Gln 对生长与生理功能相关分子 mRNA 相对表达量的影响51-52
- 3.2.3 Gln 对线粒体功能方面蛋白 mRNA 相对表达量的影响52-53
- 3.3 讨论53-60
- 3.3.1 Gln 对 EGFR、mTOR 和 AMPK 信号通路关键分子 mRNA 的相对表达量的影响53-55
- 3.3.2 Gln 对生长与生理功能相关分子 mRNA 相对表达量的影响55-59
- 3.3.3 Gln 对线粒体功能方面基因 mRNA 相对表达量的影响59-60
- 3.4 小结60-61
- 试验四 mTOR 信号通路在 Gln 调控肠上皮细胞生长中的作用61-80
- 4.1 材料与方法61-64
- 4.1.1 试验材料与方法61
- 4.1.2 培养基配方61-62
- 4.1.3 试验分组62
- 4.1.4 细胞培养62
- 4.1.5 测定指标与方法62-64
- 4.1.6 数据分析64
- 4.2 试验结果64-75
- 4.2.1 不同水平 RAP 对 IPEC 细胞生长的影响64-65
- 4.2.2 添加 Gln 与 RAP 处理对 IPEC-1 细胞生长的影响65-67
- 4.2.3 Gln 对 RAP 处理 IPEC-1 细胞相关基因表达量的影响67-69
- 4.2.4 添加 Gln 与 RAP 处理对细胞 mTOR 和 AMPK 信号通路蛋白表达的影响69-75
- 4.3 讨论75-78
- 4.3.1 RAP 对 IPEC-1 细胞生长的影响75-76
- 4.3.2 Gln 对 RAP 处理 IPEC-1 细胞生长的影响76
- 4.3.3 Gln 对 RAP 处理 IPEC-1 细胞相关 mRNA 相对表达量的影响76-78
- 4.3.4 添加 Gln 与 RAP 处理对 IPEC-1 细胞 mTOR 和 AMPK 信号通路关键分子蛋白表达的影响78
- 4.4 小结78-80
- 试验五 AMPK 信号通路在 Gln 调控肠上皮细胞生长中的作用80-98
- 5.1 材料与方法80-82
- 5.1.1 试验材料与方法80
- 5.1.2 培养基配方80
- 5.1.3 试验分组80-81
- 5.1.4 细胞培养81
- 5.1.5 测定指标与方法81
- 5.1.6 数据分析81-82
- 5.2 试验结果82-94
- 5.2.1 P5499 对 IPEC 细胞生长的影响82-83
- 5.2.2 添加 Gln 与 P5499 处理对 IPEC-1 细胞生长的影响83-85
- 5.2.3 Gln 对 P5499 处理的 IPEC 细胞相关基因 mRNA 相对表达量的影响85-87
- 5.2.4 添加 Gln 与 P5499 处理对细胞 mTOR 和 AMPK 信号通路蛋白表达的影响87-94
- 5.3 讨论94-97
- 5.3.1 P5499 对 IPEC-1 细胞生长的影响94-95
- 5.3.2 Gln 与 P5499 处理对 IPEC-1 细胞生长的影响95
- 5.3.3 Gln 与 P5499 处理对 IPEC-1 细胞相关基因 mRNA 相对表达量的影响95-96
- 5.3.4 Gln 与 P5499 处理对细胞 mTOR 和 AMPK 信号通路关键分子蛋白表达的影响96-97
- 5.4 小结97-98
- 第三章 结论和建议98-99
- 3.1 主要结论98
- 3.2 创新点98
- 3.3 有待进一步研究的问题98-99
- 参考文献99-121
- 致谢121-122
- 攻读学位期间的研究成果122
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张俊峰;陆敏强;蔡常洁;杨扬;李华;易慧敏;陈规划;;Caspase-3在雷帕霉素诱导肝癌细胞BEL-7402凋亡中的作用[J];癌症;2006年12期
2 程雷,谭广,王举,石爱平,谭毓铨,王忠裕;谷氨酰胺对阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡和相关基因Bcl-2及Bax表达的影响[J];吉林大学学报(医学版);2005年05期
3 翟莉莉;李俊霞;沈Y
本文编号：297760
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