核仁素介导的转录后调节在血管新生中的作用

发布时间：2017-04-11 00:43

  本文关键词：核仁素介导的转录后调节在血管新生中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：前言：核仁素是一种重要的RNA结合蛋白,参与核糖体RNA的转录、转运和核糖体亚基组装的调节。近期大量研究表明核仁素通过蛋白质-RNA结合方式参与多个基因mRNA稳定性的调节,这些靶mRNA分子包括：Bcl-2、P53、GADD45. IL-2等。 我室以往的实验表明核仁素参与VEGF介导的人脐静脉内皮细胞管型形成；而且核仁素心肌特异性表达可促进小鼠缺血区心肌血管新生。上述结果提示,核仁素在血管新生调节中发挥重要作用,而且核仁素亦可能在心肌细胞中调节血管新生相关因子的表达,促进其分泌,进而调节血管新生过程。然而其具体机制是否与核仁素介导某些血管新生相关基因mRNA的转录后调节有关,目前尚不清楚。 方法：本研究首先采用生物信息学分析了多个人类血管新生相关基因的mRNA序列以筛选核仁素可能结合的mRNA靶分子。随后以培养的大鼠心肌细胞H9C2和人脐静脉内皮细胞HUVEC为模型,采用蛋白质-RNA免疫共沉淀结合定量PCR技术分别证实上述潜在靶分子与核仁素的相互作用,并进一步通过基因转染方式上调或下调核仁素蛋白表达策略,采用定量PCR技术分析核仁素对上述靶基因mRNA表达以及mRNA稳定性的影响。最后建立以核仁素心肌特异性表达的小鼠心肌缺血模型,采用RNA-IP-PCR组合技术验证上述靶mRNA分子与核仁素的相互作用。通过本研究以期在转录后水平阐明核仁素对血管新生过程中的可能调控机制,为血管新生调控研究提供新的思路和视野。 结果： 1.通过生物信息学分析,发现MMP9、VEGF、hETS1、VE-Cadherin、KDR、Tie-2、MMP2等多个血管新生相关基因mRNA的3'-UTR或5'-UTR或编码区含有数量不等的核仁素结合元件"(T/G)CCCG(A/G)"序列。 2.采用蛋白质-RNA免疫共沉淀技术结和Real-time PCR分析核仁素过表达的H9C2细胞发现,上述潜在的核仁素结合靶分子中仅有MMP9和VEGF与核仁素蛋白具有相互作用。然而,在HUVEC细胞中发现,VE-cadherin、Endoglin、hETS1、Angiopoietin与核仁素蛋白具有相互作用。同时发现核仁素过表达时,两种细胞中具有相互作用的靶基因mRNA表达升高,相反,核仁素低表达时,其表达则降低。 3.进一步采用放线菌素D阻断心肌细胞H9C2基因转录后,观察已合成mRNA的降解速率发现,核仁素过表达可以提高MMP9基因mRNA的稳定性,抑制其降解,而核仁素低表达则抑制MMP9基因mRNA的稳定性,加速其降解。 4.为进一步证明上述相互作用,本研究采用蛋白质-RNA免疫沉淀分析核仁素特异性转基因小鼠缺血心肌组织发现核仁素与MMP9的mRNA存在相互结合。 结论： 1.核仁素的促血管新生作用机制可能与核仁素与相关基因VEGF、MMP9、VE-cadherin、Endoglin、ETS1、和Angiopoietin的mRNA结合,通过影响其mRNA的稳定性,从而调节蛋白质的表达水平有关。 2.核仁素通过调节心肌细胞MMP9mRNA稳定性,促进心肌细胞分泌MMP9参与血管新生的调节。
【关键词】：血管新生 核仁素 RNA结合结构域 内皮细胞 心肌细胞
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 目录10-12
• 英文缩写12-13
• 1 前言13-17
• 2 材料与方法17-24
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 实验动物17
• 2.1.2 细胞17
• 2.1.3 主要试剂及材料17
• 2.1.4 主要仪器17-18
• 2.1.5 引物序列18-19
• 2.2 方法19-24
• 2.2.1 细胞培养19
• 2.2.2 动物饲养和实验分组19
• 2.2.3 小鼠心肌缺血模型制备19
• 2.2.4 H9C2、HUVECs和心肌组织总蛋白提取和蛋白表达的免疫印迹分析19-20
• 2.2.5 H9C2、HUVECs总RNA的提取,逆转录和实时荧光定量PCR(Real-timefluorescence quantitative PCR)分析20-21
• 2.2.6 质粒的转化、扩增和抽提21-22
• 2.2.7 脂质体的瞬时转染22
• 2.2.8 蛋白质-RNA免疫共沉淀22
• 2.2.9 mRNA稳定性分析22-23
• 2.2.10 统计分析23-24
• 3 实验结果24-34
• 3.1 生物信息学分析24
• 3.2 核仁素蛋白与血管新生相关基因mRNA的相关性24-27
• 3.2.1 大鼠心肌细胞(H9C2)中与核仁素有相互作用的血管新生相关基因25-26
• 3.2.2 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中与核仁素有相互作用的血管新生相关基因26-27
• 3.3 核仁素过表达或表达抑制对上述血管新生基因mRNA的影响27-31
• 3.3.1 H9C2细胞株中核仁素过表达对上述血管新生基因mRNA的影响27
• 3.3.2 H9C2细胞株中核仁素抑制表达对上述血管新生基因mRNA的影响27-29
• 3.3.3 核仁素过表达对HUVECs细胞株中血管新生基因mRNA表达的影响29
• 3.3.4 HUVECs细胞中核仁素抑制表达对上述血管新生基因mRNA的影响29-31
• 3.4 核仁素对MMP9 mRNA稳定性的影响31-32
• 3.4.1 核仁素过表达对MMP9 mRNA稳定性的影响31-32
• 3.4.2 核仁素低表达对MMP9 mRNA稳定性的影响32
• 3.5 小鼠心肌缺血模型中与核仁素有相互作用的血管新生相关基因32-34
• 4 讨论34-36
• 5 结论36-37
• 参考文献37-42
• 综述42-55
• 参考文献49-55
• 致谢55

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