完整人抗乙肝表面抗体的克隆及重组表达

发布时间：2021-01-17 23:24

　　随着DNA重组技术应用于抗体的改造，出现了人源化鼠单抗、小分子抗体、抗体融合蛋白等各种各样的基因工程抗体，极大推进了抗体在临床上的应用。但与天然的人抗体分子相比，小分子抗体结构不完整，无法发挥Fc段介导的各种生物学效应；人源化鼠单抗则不能完全消除抗体的异源性，仍会产生不同程度的HAMA，且亲和力较低，而目前尚无一套成熟的可表达人完整抗体的表达体系。因此本研究针对以上问题，选择了兼具原核系统良好操作性和真核系统后加工性的毕赤酵母表达体系进行构建和改良，以期建立一套可克隆、表达天然人完整抗体的真核表达体系。我们应用基因重组技术，在毕赤酵母表达载体pPICZα基础上构建完成了完整人抗体表达载体pPICZαIgG，并利用PCR介导的定位突变技术对其进行改良，成功建立了完整人抗体表达体系。应用该表达体系构建重链（轻链）抗体表达文库，利用抗体的抗原特异结合活性从中筛选出具有良好临床应用前景的抗-HBs抗体，进一步在该体系中进行重组表达及发酵纯化，通过对重组蛋白的分析鉴定，评价毕赤酵母表达体系在全分子抗体克隆、筛选、表达及发酵等方面的作用，为治疗性单抗的开发研制提供理论和实验依据。一、完整人抗体表达... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：122 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

CH和CκPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱：

完 整 人 抗 乙 肝 表 面 抗 体 的 克 隆 及 重 组 表 达 轻链表达载体的构建定区 cDNA 的插入的 CH和 CκcDNA 分别经 EcoRⅠ+XbaⅠ消化酶部位,常规转化、筛选。XhoI+XbaI 内切酶p（CH）左右片段。（图 2）与预测片段长度相隆到表达载体。结果与已发表的恒定区序列 99%同源。

改造轻链和重链重组于同一载体，得到完整人抗达载体作如下改造：链表达载体中引入 ClaI 位点体多拷贝串联时连接方向性问题，应用 PCR达盒末端引入新的酶切位点。设计合成含有的 DNA 片段，分别与酶切后的重链和轻链表的表达载体。ClaI 酶切鉴定，不具有 ClaI 位重链、轻链表达载体 pPICZαIgH 和 pPICZα经 SalI 和 SpeI 酶切后电泳图谱： 单酶切 pPICZαIgH；2. 重链表达载体 pPICZα 单酶切 pPICZαIgκ；4. 轻链表达载体 pPICZ

【参考文献】：
期刊论文
[1]Expression of Hepatitis C Virus E2 Ectodomain in E.coli and Its Application in the Detection of Anti-E2 Antibodies in Human Sera[J]. Jing LIU, Xin-Xin ZHANG, Shen-Ying ZHANG, Min LU, Yu-Ying KONG, Yuan WANG, and Guang-Di LI( State Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China;2 Department of Infectious Diseases, Ruijin Hospital, Second Medical University of Shanghai, Shanghai 200025, China ).  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2004(01)
[2]人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达[J]. 邓宁,粟宽源,王珣章,龙綮新,杨林,余宙耀.  生物工程学报. 2002(05)
[3]人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选[J]. 陈竞华,王琰,刘群英,王雅明,徐建军,刘华.  中华微生物学和免疫学杂志. 1995(03)



本文编号：2983793