重组RPLP0蛋白的表达、鉴定及评价

发布时间：2021-01-28 12:25

　　目的:构建重组RPLP0蛋白的原核表达载体并诱导表达,对表达产物进行纯化鉴定及评价。方法:设计重组RPLP0蛋白基因,经PCR扩增获得目的基因;在其5′和3′端引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,构建pET41a-GST-RPLP0-6*His融合基因表达载体;对该质粒载体进行酶切鉴定和测序验证,将鉴定正确的重组质粒载体转化至大肠杆菌并以IPTG诱导表达;经过尿素溶液纯化及复性以后得到复性的重组RPLP0蛋白;采用Western blot分析重组RPLP0蛋白的免疫原性;采用ELISA法对其抗体结合性、特异性进行分析。结果:酶切及测序结果显示,本实验成功克隆出重组RPLP0蛋白基因,将获得的目的基因构建至原核表达载体pET41a,经IPTG诱导后成功表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示重组RPLP0蛋白为包涵体表达蛋白,分子量约为61 kD。Western blot检测显示重组RPLP0蛋白具有完全的免疫原性;ELISA检测显示重组RPLP0蛋白具有良好的抗体结合性和特异性。结论:表达、鉴定并分析了重组RPLP0蛋白,为深入研究RPLP0蛋白的功能及应用奠定基础。 

【文章来源】：中国免疫学杂志. 2019,35(15)北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

重组RPLP0蛋白的基因PCR扩增产物与质粒鉴定电泳图

蛋白的表达、纯化及复性的SDS-PAGE电泳图Fig．2Expression，purificationandrenaturationofrecom-binantRPLP0proteinNote:A.ExpressionofrecombinantRPLP0protein(M.Marker，1.Liquidsupernatant，2.Inclusionbodies);B.Purificationofre-combinantRPLP0protein(M.Marker，1.Inclusionbodyeluent，2.2mol/Lureasolution，3.8mol/Lureasolution);C.RenaturationofrecombinantRPLP0protein(M.Marker，1.Refoldingsupernatant，2.Refoldingprecipitation).图3重组RPLP0蛋白的免疫原性分析Fig．3ImmunogenicityofrecombinantRPLP0proteinNote:1.20ngRPLP0(Diarect);2.10ngRPLP0(Diarect);3.5ngRPLP0(Diarect).图4两种RPLP0蛋白检测血清抗核糖体P蛋白抗体的相关性分析Fig．4Correlationanalysisofserumanti-ribosomalphos-phoproteinwhichwasdetectedbytwokindsofRPLP0protein表1重组RPLP0蛋白与常见自身抗体交叉反应情况Tab．1SpecificityofrecombinantRPLP0proteinAutoantibodiesnLIAELISA(S/CO*)U1-nRNP63+0.61SmD163+0.53SS-A63+0.51SS-B63+0.31Scl-7063+0.26PM-Scl63+0.49Jo-163+0.53CENP-B63+0.43PCNA61+～2+0.55dsDNA62+～3+0.61NUC63+0.38AMAM263+0.39Note:S/CO*wasthemeanoftestforsamples．2.6重组RPLP0蛋白的抗体结合性分析如图4所示，以Diarect公司的RPLP0蛋白包被酶标板，检测患者血清中抗核糖体P蛋白抗体的OD值为因变量(x);以复性的重组RPLP0蛋白包被酶标板，检测患者血清中抗核糖体P蛋白抗体的OD值为自变量(y);进

er，1.Liquidsupernatant，2.Inclusionbodies);B.Purificationofre-combinantRPLP0protein(M.Marker，1.Inclusionbodyeluent，2.2mol/Lureasolution，3.8mol/Lureasolution);C.RenaturationofrecombinantRPLP0protein(M.Marker，1.Refoldingsupernatant，2.Refoldingprecipitation).图3重组RPLP0蛋白的免疫原性分析Fig．3ImmunogenicityofrecombinantRPLP0proteinNote:1.20ngRPLP0(Diarect);2.10ngRPLP0(Diarect);3.5ngRPLP0(Diarect).图4两种RPLP0蛋白检测血清抗核糖体P蛋白抗体的相关性分析Fig．4Correlationanalysisofserumanti-ribosomalphos-phoproteinwhichwasdetectedbytwokindsofRPLP0protein表1重组RPLP0蛋白与常见自身抗体交叉反应情况Tab．1SpecificityofrecombinantRPLP0proteinAutoantibodiesnLIAELISA(S/CO*)U1-nRNP63+0.61SmD163+0.53SS-A63+0.51SS-B63+0.31Scl-7063+0.26PM-Scl63+0.49Jo-163+0.53CENP-B63+0.43PCNA61+～2+0.55dsDNA62+～3+0.61NUC63+0.38AMAM263+0.39Note:S/CO*wasthemeanoftestforsamples．2.6重组RPLP0蛋白的抗体结合性分析如图4所示，以Diarect公司的RPLP0蛋白包被酶标板，检测患者血清中抗核糖体P蛋白抗体的OD值为因变量(x);以复性的重组RPLP0蛋白包被酶标板，检测患者血清中抗核糖体P蛋白抗体的OD值为自变量(y);进行一元线性回归分析发现，重组RPLP0蛋白包被酶标板检测血清抗核糖体P蛋白抗体的OD值与Diarect公司的RPLP0存在线性关系(F=6175.000，P＜0.0001)，一元线性回归方程?

【参考文献】：
期刊论文
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[2]真核生物酸性核糖体P蛋白的结构和功能[J]. 肖瑞琳,胡苗清,柴宝峰,梁爱华.  生命的化学. 2012(06)
[3]LMP1调节鼻咽上皮与鼻咽癌组织中p27与RPLP0蛋白的表达[J]. 赵强,张志伟,刘重元,杨科,谢妮,张婕.  中国病理生理杂志. 2012(10)
[4]抗核糖体P0蛋白抗体在系统性红斑狼疮诊断中的临床应用[J]. 胡志刚,陈国千,邹耀红,袁劲松,周颖.  中华医院感染学杂志. 2010(22)



本文编号：3004993