人体细胞体外重编程为诱导性多能干细胞关键技术的研究

发布时间：2017-04-13 08:05

  本文关键词：人体细胞体外重编程为诱导性多能干细胞关键技术的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本研究将携带胚胎特异性转录因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒颗粒感染人包皮成纤维细胞（human postnatal foreskin fibroblasts hPFF），体外重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell iPSC）；原代培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVE）体系,将表达microRNA-302-367基因慢病毒颗粒感染HUVE，探讨目的基因microRNA-302-367过表达慢病毒颗粒感染HUVE体外重编程为诱导性多能干细胞（inducedpluripotent stem cell iPSC）的关键技术。 方法（1）以最佳病毒感染复数（Multiplicity of infection，MOI值）感染hPFF,体外重编程为iPSC，通过细胞形态学、碱性磷酸酶染色进行验证及畸胎瘤成瘤实验对iPSC多向分化潜能进行鉴定（2）采用0.1%Ⅰ型胶原酶灌注人脐静脉，消化15min后收集人脐静脉内皮细胞悬液，接种于T25cm的培养瓶中，进行培养。以免疫细胞化学法进行细胞鉴定；MTS法测定细胞生长曲线。（3）将过表达绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的空病毒颗粒感染HUVE，在荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况，探讨最佳感染条件及MOI值；（4）将生长状态良好的HUVE随机分为3组：正常对照组、含绿色荧光蛋白空病毒载体感染组、目的基因感染组进行感染，第2天给予干细胞培养条件,在倒置显微镜下动态观察细胞形态变化，探讨最佳培养条件。 结果（1）在最佳MOI值40的慢病毒感染条件下感染hPFF,感染7天后，细胞伪足收缩，形态由长梭形变为圆形，感染25天后，可挑选细胞克隆；碱性磷酸酶染色为阳性；畸胎瘤成瘤实验证实iPSC具有向内、中、外三个胚层分化的潜能（2）0.1%Ⅰ型胶原酶消化人脐静脉体外建立稳定的HUVE系，，培养3天后，0.25%胰蛋白酶消化传代。免疫细胞化学法SABC法鉴定HUVE细胞第VIII因子相关抗原呈阳性结果。(3)本实验室培养条件下，慢病毒感染HUVE的最佳MOI值为10，经PCR检测microRNA-302-367过表达慢病毒颗粒能有效感染HUVE。 结论本研究成功地将hPFF体外重编程为iPSC；本研究于体外建立稳定的HUVE系；慢病毒颗粒可有效地感染hPFF、HUVE。
【关键词】：人包皮成纤维细胞 人脐静脉内皮细胞 慢病毒 重编程 诱导性多能干细胞
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 中英文简写对照5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-13
• 第一部分 人包皮成纤维细胞体外诱导为多能干细胞13-21
• 一、实验目的13
• 二、实验材料13-14
• 三、实验方法14-17
• 四、实验结果17-19
• 五、 讨论19-21
• 第二部分 人脐静脉内皮细胞原代培养及体外诱导为多能干细胞的实验研究21-36
• 第一章 人脐静脉内皮细胞的原代培养21-27
• 一、实验目的21
• 二、实验材料21-22
• 三、实验方法22-24
• 四、实验结果24-26
• 五、讨论26-27
• 第二章 人脐静脉内皮细胞体外诱导为多能干细胞的实验研究27-36
• 第一节 表达绿色荧光蛋白基因的慢病毒颗粒感染人脐静脉内皮细胞的实验研究27-32
• 一、实验目的27
• 二、实验材料27
• 三、实验方法27-28
• 四、实验结果28-30
• 五、讨论30-32
• 第二节 microRNA(miR-302-367）慢病毒颗粒感染人脐静脉内皮细胞的实验研究32-36
• 一、实验目的32
• 二、实验材料32
• 三、实验方法32-33
• 四、实验结果33-34
• 五、讨论34-36
• 结论36-37
• 参考文献37-41
• 致谢41-42
• 综述42-50
• 参考文献47-50

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本文编号：303148