卵巢癌相关抗原CA125的原核表达、纯化及其抗体的制备

发布时间：2017-04-13 09:27

  本文关键词：卵巢癌相关抗原CA125的原核表达、纯化及其抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：CA125是由Bast[1]等于1983年发现并命名，其血清学水平在卵巢癌等恶性肿瘤病人异常升高。CA125自发现以来一直作为卵巢癌常规筛查、辅助诊断及疗效评估的肿瘤标志物[2]。目前临床检测及基础实验研究等所用CA125抗体大多是依靠进口，价格昂贵，检测成本高，限制其在临床的进一步应用。因此，建立快速、高效、经济的制备CA125抗体的方法，对CA125试剂盒开发及相关基础研究都具有重要的意义。 目的： 1.建立快速高效经济的CA125串联重复序列（CA125R）原核表达系统，，表达、分离纯化CA125R蛋白并鉴定。 2.制备兔抗CA125R蛋白的抗血清，分离纯化多克隆抗体并鉴定其识别天然CA125蛋白的特异性。 3.制备鼠抗CA125R蛋白的单克隆抗体，并鉴定其识别天然CA125糖蛋白的特异性。 方法： 1.全基因合成一段CA125串联重复序列（CA125R），并将此片段连接至pGEX-6P-1及pET-32a(+)原核表达载体，构建重组原核表达质粒pGEX/CA125R及pET/CA125R。 2.分别将pGEX/CA125R和pET/CA125R转化至大肠杆菌BL21（DE3），确定最佳表达条件后，诱导表达重组蛋白，分别经GST亲和层析和镍离子亲和层析系统分离纯化重组蛋白，并鉴定所纯化的重组蛋白。 3.将纯化的重组CA125R蛋白免疫新西兰大白兔，制备抗血清，经蛋白A抗体纯化系统分离纯化多克隆抗体，并鉴定。 4.将纯化的重组CA125R蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，筛选阳性克隆，并进一步克隆化，建立稳定分泌抗CA125单克隆抗体杂交瘤细胞系，采用小鼠腹水诱生法大量制备单克隆抗体，制备的抗体经蛋白A纯化系统纯化并鉴定。 结果： 1.经基因重组技术，成功建立CA125R原核表达系统，分别通过GST亲和层析及镍离子亲和层析系统分离纯化得到GST-CA125R和TRAX-CA125R重组蛋白。 2.将纯化的TRAX-CA125R重组蛋白免疫家兔，制备其抗血清，并经纯化得到其多克隆抗体，多克隆抗体经Western blot验证能特异识别天然CA125糖蛋白，具有应用价值。 3.将纯化的GST-CA125R重组蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术，将免疫的小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行融合，成功获得一株稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经腹水诱生及纯化获得高纯度的抗CA125单克隆抗体。 结论： 采用基因重组技术，成功建立快速经济高效的重组CA125R原核表达系统，纯化获得了高纯度的重组CA15R蛋白；以纯化的TRAX-CA125R蛋白为免疫原，制备了兔抗CA125多克隆抗体，制备的抗体能特异识别天然CA125糖蛋白；以GST-CA125R蛋白为免疫原，成功获得一株稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备了高纯度的单克隆抗体，为以后的相关基础研究和临床试剂盒开发奠定了基础。
【关键词】：CA125 原核表达 多克隆抗体 单克隆抗体
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R737.31;R392
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 CA125 串联重复序列的原核表达、纯化及鉴定16-35
• 1 材料与方法16-28
• 2 结果28-32
• 3 讨论32-34
• 4 小结34-35
• 第二部分 CA125 抗体制备、纯化及鉴定35-48
• 1 材料与方法35-40
• 2 结果40-45
• 3 讨论45-47
• 4 小结47-48
• 全文总结48-49
• 参考文献49-51
• 文献综述51-61
• 参考文献54-61
• 致谢61-62
• 攻读学位期间撰写和发表的学术论文62-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 梁勤东;马婷婷;董晋豫;李武县;汪先桃;李紫微;王秦;熊海玉;涂植光;;卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备[J];中国生物制品学杂志;2013年10期

2 秦兰霞,徐德昌,王荣春;大肠杆菌异源重组蛋白质的变性与复性[J];生物信息学;2005年03期

3 王开友;张鲁平;王颖;潘琪;;血管内皮生长因子对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响[J];中国矫形外科杂志;2007年19期

4 白飞虎;李来生;郭新宁;杨力;翟惠虹;聂勇战;王钧;吴开春;樊代明;;胃癌腹膜高转移潜能细胞系的建立及其生物学特性[J];肿瘤防治研究;2006年03期

5 梁勤东;郭变琴;汪仙桃;李武县;董晋豫;王秦;涂植光;;卵巢癌相关抗原CA125串联重复序列的原核表达纯化及抗血清制备[J];细胞与分子免疫学杂志;2012年11期

  本文关键词：卵巢癌相关抗原CA125的原核表达、纯化及其抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：303296