骨髓内皮祖细胞移植治疗糖尿病模型大鼠周围神经病变的经验研究

发布时间：2017-04-15 07:01

  本文关键词：骨髓内皮祖细胞移植治疗糖尿病模型大鼠周围神经病变的经验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 糖尿病是由多种病因引起的一种内分泌代谢紊乱性疾病，其并发症对人体造成的危害很大。糖尿病神经病变，尤其是糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN），是最常见的糖尿病并发症之一。在DPN的诸多因素中，氧化应激和血管受损起着至关重要的作用。诸多研究表明，改善氧化应激状态和修复受损的血管有利于神经病变的恢复。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作为一种干细胞，具有分化成血管内皮细胞且参与新血管形成的功能。研究表明，EPCs数量的减少和功能受损与血管功能受损密切相关。应用EPCs移植能有效修复受损血管、治疗缺血性疾病。EPCs移植对糖尿病神经病变是否有效，是否改善氧化应激且有益于神经修复尚缺乏足够研究。目前，该领域研究是国内外学者关注的热点问题。目的： 采用大鼠骨髓EPCs移植治疗糖尿病模型大鼠坐骨神经病变，移植前后测定坐骨神经运动神经传导速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）、观察坐骨神经病理学变化并检测核转录因子κB（nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB）及髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）的表达，评价EPCs移植治疗DPN的疗效并探讨其机制。方法：1大鼠骨髓EPCs的分离、培养及鉴定1.1大鼠骨髓EPCs的分离与培养 用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离单个核细胞，用培养基将细胞重悬后接种于用人纤维连接蛋白包被的培养瓶中进行培养。1.2大鼠骨髓EPCs的鉴定 用双荧光染色法和matrigel凝胶成血管实验鉴定EPCs。2DPN模型大鼠的制备 雄性SD大鼠，体重220-240g，适应性喂养7天后禁食12小时，次日用1%链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）一次性大量腹腔注射制备糖尿病模型大鼠，72小时后针刺尾尖取血测空腹血糖，血糖值≥16.7mmol/L为糖尿病造模成功的标准。在用STZ造糖尿病模型前我们测定10只血糖正常大鼠的坐骨神经MNCV，糖尿病大鼠分别在4、8、12周时取10只测定其坐骨神经MNCV。与血糖正常大鼠相比，当糖尿病大鼠的坐骨神经MNCV减慢，差异有统计学意义时，我们认为DPN模型大鼠造模成功。3实验分组 NC组：血糖正常大鼠（10只） A组：DPN模型大鼠（10只） B组：DPN模型大鼠+生理盐水（10只） C组：DPN模型大鼠+EPCs（10只）4移植体外培养的EPCs C组大鼠成糖尿病模型12周时，收集从正常大鼠骨髓中提取并培养至第7天的EPCs，用生理盐水溶解后沿坐骨神经肌肉注射1ml（含1×106个细胞）；B组大鼠成糖尿病模型12周时沿坐骨神经注射等量生理盐水。5坐骨神经MNCV的测定 NC组和A组在糖尿病12周时，B组和C组在移植治疗4周时测定MNCV。方法：用10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉大鼠后，暴露其坐骨神经，用NTS-2000肌电图与诱发电位仪测定坐骨神经MNCV。6坐骨神经病理学标本的制备 NC组和A组在糖尿病12周时，B组和C组在移植治疗4周时制备病理学标本。方法：制备HE染色标本和电镜标本，在光学显微镜和电子显微镜下观察坐骨神经的病理学改变。7坐骨神经中NF-κB和MBP的测量 NC组和A组在糖尿病12周时，B组和C组在移植治疗4周时检测NF-κB和MBP的表达。方法：用免疫组织化学法在光学显微镜下观察大鼠坐骨神经中NF-κB和MBP的表达。结果： 1用密度梯度离心法在体外成功分离培养获得大量EPCs。 2糖尿病12周时大鼠的坐骨神经MNCV较血糖正常大鼠明显减慢，差异有统计学意义（P＜0.01）。 3坐骨神经MNCV与NC组相比，A组和B组的MNCV明显减慢，有统计学差异（P＜0.01）；C组的MNCV与NC组无统计学差异（P＞0.05）。 4HE染色结果A组：神经纤维数量减少，髓鞘薄厚不均并出现空泡变性，轴索变细；B组：神经纤维数量进一步减少，髓鞘薄厚严重不均并出现严重空泡变性，轴索变细甚至消失；C组：髓鞘薄厚不均、空泡变性及轴索变性均较B组减轻，但较A组严重。 5电镜结果A组:髓鞘薄厚不均，部分板层分离，呈弯曲扭转状态，部分增生到轴索内，轴索变细；雪旺细胞细胞器变性，染色质凝集，核膜不完整。B组:髓鞘薄厚严重不均，板层消失范围更大，高度弯曲扭转，轴索变细甚至闭锁；雪旺细胞细胞器进一步变性甚至消失，染色质凝集甚至核固缩，核膜不完整；C组:髓鞘薄厚不均情况较轻，板层结构大部分存在；雪旺细胞细胞器基本正常，核膜完整，染色质呈凝集状态。 6NF-κB表达情况与NC组相比，A组坐骨神经中NF-κB表达增加，有统计学意义（P＜0.01）；C组NF-κB表达量较A组减少（P＜0.05），但仍高于NC组（PPA＜0.01，PIOD＜0.05）。 7MBP表达情况与NC组相比，A组坐骨神经中MBP表达减少，有统计学差异（P＜0.01）；C组MBP表达量与A组相比无统计学差异（P＞0.05），但较B组增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论： 1糖尿病模型大鼠成模12周后能成功构建DPN模型大鼠； 2EPCs移植能改善DPN模型大鼠的坐骨神经MNCV、脱髓鞘及轴索萎缩等病理学改变； 3EPCs移植能抑制NF-κB、增加MBP的表达，这可能有利于神经损伤的修复。
【关键词】：内皮祖细胞 糖尿病模型大鼠 周围神经病变
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R587.2;R-332
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 英文缩略词表13-14
• 1 引言14-16
• 2 材料和方法16-22
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 主要仪器与设备16
• 2.1.2 主要试剂16-17
• 2.1.3 实验动物17
• 2.1.4 柠檬酸缓冲液的配制17
• 2.1.5 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）的配制17-18
• 2.2 实验方法18-21
• 2.2.1 大鼠骨髓 EPCs 的分离与培养18
• 2.2.2 大鼠骨髓 EPCs 的鉴定18-19
• 2.2.3 DPN 模型大鼠的制备19
• 2.2.4 实验分组19
• 2.2.5 移植体外培养的 EPCs19
• 2.2.6 坐骨神经 MNCV 的测定19-20
• 2.2.7 坐骨神经病理学标本的制备20-21
• 2.2.8 免疫组织化学法测量坐骨神经中 NF-κB 的表达21
• 2.2.9 免疫组织化学法测量坐骨神经中 MBP 的表达21
• 2.3 统计学分析21-22
• 3 结果22-30
• 3.1 大鼠骨髓 EPCS 的分离与培养22
• 3.2 大鼠骨髓 EPCS 的鉴定22-23
• 3.2.1 双荧光染色法鉴定 EPCs22-23
• 3.2.2 matrigel 凝胶成血管实验鉴定 EPCs23
• 3.3 DPN 模型大鼠23-24
• 3.4 各组大鼠的一般情况24
• 3.5 坐骨神经 MNCV24
• 3.6 坐骨神经的病理学改变24-26
• 3.6.1 光学显微镜下观察大鼠坐骨神经的病理学改变24-25
• 3.6.2 透射电子显微镜下观察大鼠坐骨神经的超微结构改变25-26
• 3.7 各组大鼠坐骨神经中 NF-ΚB 的表达情况26-27
• 3.8 各组大鼠坐骨神经中 MBP 的表达情况27-30
• 4 讨论30-34
• 5 结论34-36
• 参考文献36-38
• 文献综述38-56
• 参考文献50-56
• 致谢56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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  本文关键词：骨髓内皮祖细胞移植治疗糖尿病模型大鼠周围神经病变的经验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：307840