阴沟肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性的初步研究

发布时间：2017-04-15 08:29

  本文关键词：阴沟肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）是肠杆菌科革兰阴性杆菌，广泛分布于自然界，亦可存在于人和动物肠道中。阴沟肠杆菌是临床感染常见的致病菌，可引起败血症、呼吸道感染、尿道感染和腹膜炎等疾病。近年来，由于阴沟肠杆菌对β-内酰胺酶类、喹诺酮类及氨基糖苷类抗生素均出现较高耐药率，使得治疗该细菌感染面临难题。 噬菌体是一类可以侵袭细菌的病毒，广泛分布于自然界中，，对其宿主菌具有高度的特异性和高效裂解性，有望成为新型的抗菌制剂。虽然噬菌体的研究开展已久，但国内外尚未见有关阴沟肠杆菌噬菌体的深入研究报道。 本研究以阴沟肠杆菌为宿主菌，从居民区污水中分离获得4株阴沟肠杆菌噬菌体，通过噬斑法反复纯化，筛选出1株裂解性强的毒性噬菌体，命名为ФEc53，并对其进行了生物学特性的研究及抗感染应用的初步研究。 噬菌体ФEc53的生物学特性 经3~5次反复纯化后，在双层琼脂上可形成直径约为2～4mm的圆形、透明、边界清晰的噬菌斑。电子显微镜下，该噬菌体头部呈球形，直径约60nm，有一长尾约130nm。根据噬菌体的新分类法，ФEc53属于有尾病毒目、管尾噬菌体科（Caudovirales，Siphovirida）。对ФEc53提取核酸后进行脉冲场电泳及琼脂糖凝胶电泳，结果表明：该噬菌体的基因组大小为37.7kb左右，含EcoRⅠ、EcoRⅤ、BamHⅠ和NdeⅠ的多个酶切位点。通过SDS-PAGE对噬菌体蛋白进行分析表明，噬菌体颗粒至少含有8种衣壳蛋白，其中相对分子量为22kD的蛋白条带含量较大，表明这种蛋白在噬菌体病毒颗粒中所占比例较高，可能为主要衣壳蛋白。 将噬菌体与宿主菌按照一定比例（分别为MOI=0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001）进行混合，37℃振荡培养，每隔12min取出测定细菌浓度，确定最佳感染复数为0.01。选取最佳感染复数进行一步生长曲线的测定及绘制，噬菌体ФEc53感染宿主菌的潜伏期约为5min，根据爆发量=噬菌体爆发末期的噬菌体滴度/感染初期细菌的浓度的公式计算，爆发量为6.06×10~3PFU/cell，在50min时到达平台期。 通过超滤的浓缩方法可提高噬菌体滴度，并降低内毒素含量。经宿主特异性及裂解范围实验表明，该噬菌体有高度的特异性，仅能裂解1株阴沟肠杆菌，为窄谱噬菌体。经过7个月的保存实验证明：保存于4℃和-70℃中的噬菌体的滴度并未发生明显变化。 噬菌体对皮下脓肿感染动物模型的治疗实验 建立家兔皮下脓肿感染模型，皮下注射阴沟肠杆菌53后，立即在相同部位皮下注射ФEc53，观察并记录脓肿情况，测定脓肿部位、肝脏及脾脏内的细菌数量及噬菌体滴度。结果表明，噬菌体治疗组脓肿面积随时间推移逐渐减小，脓肿内部细菌量有所下降的同时噬菌体量有所升高。 本实验初步研究了ФEc53的生物学特性及其抗感染治疗，为今后噬菌体的深入研究提供一些依据。
【关键词】：阴沟肠杆菌 噬菌体 生物学特性 噬菌体治疗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 文献回顾11-19
• 1.1 噬菌体的结构、抗菌机制及特点11-13
• 1.1.1 噬菌体的结构11
• 1.1.2 噬菌体的抗菌机制11-13
• 1.1.3 噬菌体的抗菌特点13
• 1.2 噬菌体的发现及初期研究13-14
• 1.3 二战后东欧噬菌体研究发展14-15
• 1.4 西欧及美国地区肠杆菌科细菌的噬菌体研究进展15-17
• 1.4.1 大肠埃希菌噬菌体研究15-16
• 1.4.2 铜绿假单胞菌噬菌体研究16
• 1.4.3 其他肠道杆菌噬菌体的情况16-17
• 1.5 噬菌体研究的发展趋势17-19
• 1.5.1 噬菌体基因结构的改造17
• 1.5.2 噬菌体基因编码产物的开发与应用17-19
• 第2章 阴沟肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性的研究19-39
• 2.1 材料与方法19-28
• 2.1.1 材料19-21
• 2.1.2 方法21-28
• 2.2 结果28-36
• 2.2.1 阴沟肠杆菌的 16S rRNA 鉴定28-29
• 2.2.2 阴沟肠杆菌噬菌体的分离及纯化29
• 2.2.3 噬菌体的电镜观察29-30
• 2.2.4 噬菌体的核酸提取及酶切分析30-31
• 2.2.5 噬菌体蛋白的 SDS-PAGE 凝胶电泳31-33
• 2.2.6 最佳感染复数的测定33
• 2.2.7 一步生长曲线的绘制33-34
• 2.2.8 噬菌体的浓缩及内毒素的去除34
• 2.2.9 噬菌体的保存34-35
• 2.2.10 宿主菌的特异性判定和裂解谱实验35-36
• 2.3 讨论36-39
• 第3章 阴沟肠杆菌噬菌体抗感染的初步应用39-47
• 3.1 材料39-40
• 3.1.1 实验菌株39
• 3.1.2 实验用噬菌体39
• 3.1.3 实验动物39-40
• 3.1.4 实验器材40
• 3.2 方法40-42
• 3.2.1 制备菌悬液及测定菌液浓度40
• 3.2.2 制备噬菌体悬液及测定其滴度40
• 3.2.3 家兔皮下脓肿模型的建立40-41
• 3.2.4 噬菌体治疗41-42
• 3.3 结果42-44
• 3.3.1 家兔皮下脓肿生长情况42-43
• 3.3.2 各组织内细菌浓度的测定43
• 3.3.3 各组织内噬菌体滴度的测定43-44
• 3.4 讨论44-47
• 第4章 结论47-48
• 参考文献48-54
• 作者简介54-55
• 在学期间取得的科研成果55-56
• 致谢56

【参考文献】

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1 孙荣华;大肠埃希菌噬菌体生物学特性及其抗感染初步研究[D];吉林大学;2009年

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本文编号：307968