人源抗TLR4基因工程抗体Fab的制备、表达及特性分析

发布时间：2017-04-15 09:00

  本文关键词：人源抗TLR4基因工程抗体Fab的制备、表达及特性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：TLR4是Toll样受体家族成员之一，在对TLR4的研究中发现TLR4通过依耐MyD88途径或不依耐MyD88途径介导LPS的信号传导，从而在病原体入侵机体的早期即可启动免疫，其在抗感染治疗中起非常关键的作用[1-4]。阻断TLR4介导的内毒素信号向细胞内的传导，是减轻内毒素生物学效应的有效的方法。本课题前期进行的鼠源性的抗TLR4抗体的研究中，获得鼠抗人TLR4的单克隆抗体，体外细胞试验显示其对LPS刺激产生的a-TNF有明显的抑制作用[5]。但人体对鼠源性抗体会产生HAMA（human anti-mouse antibody），产生强烈的免疫反应，限制了其临床应用。噬菌体抗体库展示技术是近年发展的单克隆抗体制备的一项新技术，它改变了单克隆抗体制备的传统途径，它模拟机体产生抗体的过程，从而使得在体外就可以获得特异性的单克隆抗体[6]。本课题运用噬菌体抗体库技术在人体库中进行筛选，成功获得了人源抗TLR4抗体的Fab的基因片段，并构建该Fab的原核表达载体，对其表达的蛋白进行活性分析。 方法： 1、采用抗原固相筛选法：以纯化的重组hTLR4蛋白为靶抗原，从人源噬菌体Fab抗体库中筛选，经“吸附、洗脱和扩增”三个环节，经五轮筛选后，随机挑取的80个克隆，经phage ELISA验证，，获得11株阳性克隆，对阳性克隆进行测序，发现11株阳性克隆的抗体可变区基因序列相同，最终获得一株人源抗TLR4抗体Fab，将其命名为抗hTLR4Fab-1。 2、将筛选获得的阳性克隆质粒经PCR扩增后获得VL和Fd，构建pET-Duet1表达载体，将重新构建的质粒转入大肠杆菌Origami2（DE3），诱导其表达抗hTLR4Fab-1。 3、将诱导表达的抗hTLR4Fab-1包涵体蛋白经变性、复性后，用Protein L柱纯化，纯化后抗体Fab经SDS-PAGE、Western-bolt及ELISA分析鉴定。 4、通过细胞学检测抗hTLR4Fab-1对LPS诱导的人PBMC的TNF-α表达的影响，观察该抗体是否能阻断hTLR4对LPS的信号传导，减轻LPS诱导的炎症反应，判断其活性。 结果： 1、将筛选获得的11株阳性克隆扩增后，进行核酸序列测定和比对分析，结果显示，所得到的阳性克隆的抗体可变区基因相同，其可变区基因序列正确。通过五轮筛选，获得一株人源抗TLR4抗体Fab，命名为抗hTLR4Fab-1。 2、抗hTLR4Fab-1表达载体转化大肠杆菌，抗体以包涵体的形式大量表达，经变性、复性后，VL及Fd能正确的组装；经Protein L柱纯化后，可获得纯度较高的抗体。 3、ELISA结果显示，本实验方法获得的抗体能够与hTLR4特异性结合。 4、体外细胞学研究结果实验表明：人源抗体hTLR4Fab-1能够明显阻断LPS诱导的人PBMC细胞表达TNF-α，抑制率达76.25%。 结论： 1、通过噬菌体抗体库技术，采用固相筛选方法可获得抗hTLR4的特异性基因工程抗体Fab。 2、应用原核表达技术，该Fab在大肠杆菌Origami2（DE3）中以包涵体的形式大量表达。通过优选条件，对包涵体蛋白进行变性、复性、纯化，最终获得高纯度、有生物学活性的抗体。 3、抗hTLR4抗体片段Fab能与hTLR4特异性结合，并可抑制LPS诱导的人PBMC细胞表达TNF-α，减轻LPS诱导的炎症反应。 本研究制备的人源抗体TLR4抗体Fab可与hTLR4特异性结合，并能有效阻断LPS诱导的人PBMC细胞表达TNF-α，减轻LPS诱导的炎症反应，从而达到保护机体的作用。
【关键词】：噬菌体展示 人源化抗体Fab TLR4 LPS 活性分析
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 研究一 人源抗 TLR4 基因工程抗体 Fab 的筛选与鉴定12-25
• 1.材料与方法12-21
• 2.结果21-23
• 3.讨论23-25
• 研究二 人源抗 TLR4 基因工程抗体 Fab 的表达、纯化与特性分析25-37
• 1.材料与方法25-32
• 2.结果32-35
• 3.讨论35-37
• 小结37-38
• 参考文献38-41
• 附录一：文献综述41-46
• 参考文献44-46
• 附录二：缩略语46-47
• 在读期间参与的工作和发表的文章47-48
• 致谢48

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 何维;Toll样受体和天然免疫[J];第二军医大学学报;2002年10期

2 胡承香,杨清武,吕凤林,徐祥;CD14与TLR4相互作用的实验研究[J];第三军医大学学报;2004年10期

3 汪茂荣;朱进;张怡青;张馨;熊熙;;抗人Toll样受体4单克隆抗体的制备及其生物活性研究[J];免疫学杂志;2011年07期

4 闻平;细菌内毒素研究进展[J];齐鲁医学检验;2005年01期

5 方敏,黄华j;包涵体蛋白体外复性的研究进展[J];生物工程学报;2001年06期

6 程姝娟,薛桥,王士雯;Toll样受体4在内毒素血症小鼠心肌TNF-α表达中的作用初探[J];中华老年多器官疾病杂志;2004年01期

  本文关键词：人源抗TLR4基因工程抗体Fab的制备、表达及特性分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：308033