假型病毒载体介导tPA基因转导乳鼠心肌成纤维细胞的实验研究

发布时间：2021-04-15 06:31

　　目的：通过新构建的假型逆转录病毒载体（VSV-G／MuLV），介导组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plaminogen activator，tPA）基因，转导乳鼠心肌成纤维细胞，探索心肌成纤维细胞成为tPA基因治疗靶细胞的可能性。 方法： 1、疹型口炎病毒壳G糖蛋白（VSV-G）替代MuLV的enV蛋白，从而产生一种有转染能力的以MuLV为基础的病毒载体，称为VSV-G假型MuLV载体（VSV-G／MuLV），通过293T／17细胞共转染质粒pCnBgSN、pHIT60（for gal-pol）和pCVG（for VSV-G），采用磷酸钙共沉淀法产生；VSV-G／MuLV病毒生产细胞293／GPG的产生；VSV-G／MuLV病毒上清的收集及滴度测定。 2、采用两次差速贴壁法（每次持续60分钟）分离、培养乳鼠心肌成纤维纤胞；通过倒置显微镜观察心肌成纤维细胞的形态学特征；用免疫细胞化学染色法（SP法）鉴定心肌成纤维细胞。 3、制备含tPA基因假型病毒载体VSV-G／tPA，通过质粒pHIT60（for gal-pol）、pCVG（for VSV-G）和... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：79 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

vsv一G/MuLv病毒滴度测定讨论

无自发性搏动(图1)。2SP免疫细胞化学染色结果心肌成纤维细胞波形蛋白呈强阳性反应，即细胞浆内围绕细胞核呈棕褐色颗粒状改变，阳性率在95%以上(图2、3);肌动蛋白呈阴性反应，即细胞浆内围绕细胞核呈棕褐色颗粒状改变数在码以下(图4);PBS对照呈阴性(图5)。图1倒置显微镜下心肌成纤维细胞(x40)

图6倒置显微镜下心肌细胞(x40)讨论1心肌成纤维细胞与心肌细胞的分离和纯化心脏细胞包括心肌细胞和心肌间质细胞，心肌间质细胞中，心肌成纤维细胞大多数，研究心肌成纤维细胞和心肌细胞在心脏疾病的发生、发展、心血管作用机制及这两种细胞之间的相互作用，已越来越受到人们的关注。心肌成细胞与心肌细胞的分离和纯化是心脏生理学研究中非常重要的一个环节，大用差速贴壁分离法。经典的差速贴壁分离法是:用胰蛋白酶消化心肌组织所混合细胞悬液，接种在适当大小的培养瓶中，37℃静置如min，轻轻振摇后尚未贴壁的心肌细胞，重新接种，可得纯度大于95%的心肌细胞，而原培养的贴壁细胞几乎全部为心肌成细胞，其纯度也可达到大于90%。所取贴壁的各有不同。短到20min‘3’，长至3h，通常以如min多用。此方法具有操作

【参考文献】：
期刊论文
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[2]体外培养心脏成纤维细胞增殖的检测方法[J]. 林岚,洪华山,王一波,江琼.  福建医科大学学报. 2000(01)
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本文编号：3138831