丙型肝炎病毒多表位抗原的基因合成与免疫原性研究

发布时间：2021-06-01 04:32

　　丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）的感染呈世界性分布，能引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝细胞癌。目前，全球HCV感染者1.7～2亿人，我国一般人群HCV感染率约为2％，约3800万HCV感染者。成人感染者约50％～80％发展成慢性，其中约20％可发展为肝硬化，1％～4％可发展为肝癌。由于目前无HCV疫苗预防感染，而且，干扰素和利巴韦林联合治疗的应答率约为40％，因此，研制HCV疫苗具有重要的意义。HCV基因组全长一般在9379～9481nt之间，编码一个约含3000个氨基酸的多聚蛋白前体，在宿主和病毒自身蛋白酶的加工下产生结构蛋白（C、E1和E2）和非结构蛋白（NS2、NS3、NS4和NS5等）。HCV感染的最大病理特点为：慢性感染者体内的免疫反应不能有效清除病毒体，病毒以准毒株（quasispecies）形式存在于宿主体内。本研究针对HCV的高度变异及免疫学特点，首先设计合成出HCV多表位抗原基因（multi-epitope fragment combination，mfc），将其同gst基因融合后原核表达，获得了HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC，分析了HCV... 

【文章来源】：中国人民解放军海军军医大学上海市 211工程院校

【文章页数】：88 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

多表位抗原融合蛋白GST-MFC在大肠杆菌中的表达Fig.1一3TlleexPressionofGST-MFCProteioinESche月‘h扭coltBL21口E3)

见相对分子量约为57.6KDa的多表位抗原融合蛋白GST-MFC的表达，与设计完全相符。高效表达的重组菌能表达可溶性多表位抗原融合蛋白约占菌体蛋白的l~5%，见图1一3。经过对起始诱导的菌液浓度、诱导温度及诱导时间的分析，最终确定在摇瓶中发酵表达可溶性多表位抗原融合蛋白的最佳诱导条件见表1一3。图1一3多表位抗原融合蛋白GST-MFC在大肠杆菌中的表达Fig.1一3TlleexPressionofGST-MFCProteioinESche月‘h扭coltBL21口E3)LanelandIine10:Marker;Lane2andlane4:ExPress宜onofPGEX-4T-1in2eontrolreeombinants:Lane3andlanes~laneg:ExPressionofPGEX-4T-MFCin6reeombinants.表1一3诱导可溶性多表位抗原融合蛋白在大肠杆菌中表达的最适条件Tablel·3TheoPtimaleonditionsofthoexPressionofsolubleGST·MFCProteinIPTG浓度0.6mmol/L起始诱导的菌液浓度诱导温度诱导时间1.0左右28℃摇床转速220rpn口min2.2多表位抗原融合蛋白的亲和层析纯化及蛋白浓度测定在多表位抗原融合蛋白的亲和层析纯化中，为获得更多的可溶蛋白，我们尝试在超声破碎菌体时加入溶菌酶或Tritonx·100或DTr，发现加入溶菌酶和TritonX一100虽然可以使细菌几乎完全破碎，但是，却在后期纯化中得不到可溶性多表位抗原融合蛋白，而加入D竹可略微增加可溶蛋白的获得.同时，我们尝试分别用1011111101几、20mmol/L及3Omm。比的还原性谷胧甘肤(溶于son”no比Tris一HCI，PHS.0)来洗脱多表位抗原融合蛋白

用丙肝患者阳性血清(l:10稀释)作为一抗，用HRp.兔抗人lgG(1:1000稀释)作为二抗，Westemblot杂交检测发现，丙肝患者阳性血清可特异性识别多表位抗原融合蛋白，而不识别单纯的GST蛋白，见图1·5。结果表明，MFC蛋白具有模拟HCV某些抗原表位的特性，推测主要为HVRI区的中和表位。但是，我们发现多数丙肝患者阳性血清稀释到1:200以上，几乎不能检测到杂交带，提示丙肝患者阳性血清中的抗HVRI抗体滴度较低。图1一SW七sternblot杂交检侧内肝思者阳性血清别识HCV多表位抗原融合蛋白GST-MFC反应Fig.1一5叭阳sternblotofGST-MFCProteinWithanti-HCVseru口1:BSA;2:GST-MFC2.5INSIGHTll和DNAM[AN的分析2.5.1INSIGHTll软件分析结果本研究表达的MFC蛋白是完全人工设计的，对其空间构象的预测具有科学意义，并可为进一步研究提供帮助。Insishtn软件包的seqFold模块是序列同结构相似性的打分函数，由于se叮old基于序列和结构二者的兼容性


本文编号：3209656