中性粒细胞自发性凋亡相关miRNA的鉴定及功能研究

发布时间：2017-04-23 01:06

  本文关键词：中性粒细胞自发性凋亡相关miRNA的鉴定及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）是人体重要的炎症细胞，参与机体对病原微生物的防御，在人体非特异性免疫反应起着重要的作用。中性粒细胞自骨髓释放至外周血循环后其生命期限仅24~48h，一旦进入血液循环即启动自发性凋亡程序来维持其数量的平衡和内环境的稳定，对炎症的发生、发展及转归起着重要的作用。miRNA是一类非编码小RNA,长度约为18~24个核苷酸，它通过与靶mRNA的3'端非编码区域结合，降解mRNA或阻止mRNA的翻译，发挥负性调节作用。本研究通过检测自发性凋亡进程中中性粒细胞差异表达的miRNA，探讨miRNA在中性粒细胞自发性凋亡过程中的作用，为中性粒细胞自发性凋亡机制的研究提供新思路，也为炎症性疾病的诊断及治疗方法的选择提供新的依据。方法：（1）分离人外周静脉血中性粒细胞，鉴定其活力与纯度，并分组培养不同的时间。对照组：新鲜分离（0h）中性粒细胞；实验组：分离后分别培养12h和24h的中性粒细胞；（2）分别收集各组细胞并提取总RNA；（3）应用数字基因表达谱技术（DGE）检测和筛选0h和24h中性粒细胞差异表达的mRNA，差异超过2倍为有意义结果；（4）应用Affymetrix miRNA芯片检测和筛选对照组和实验组差异表达的miRNA，，差异超过2倍为有意义结果；（5）从筛选出的差异表达的miRNA中选取4个（miR-4419a、miR-487b、miR-4417、 miR-432）进行Northern Blot检测，验证芯片结果的可靠性；（6）对差异表达的miRNA应用www.mirbase.org、www.targetscan.org和mirdb.org三个数据库进行靶基因预测，对三个数据库的结果取交集；得到的结果再与DGE结果相结合，筛选二者的共同结果；（7）将从靶基因预测和DGE共同的结果中选取2个与细胞凋亡密切相关的基因（PKCβ和MCL1），应用RT-PCR和Western Blot进行表达检测，确定miRNA、相关靶基因与中性粒细胞自发性凋亡的相关性。结果：（1）DGE共筛选出差异表达的基因1,317个，其中包含多个与细胞凋亡相关的基因；（2）miRNA芯片结果：以0h组为对照，12h组表达上调的miRNA有21个，下调的有21个，24h组表达上调的有41个，下调的有22个，其中12h和24h组共同上调的有13个，共同下调的有11个；（3）Northern Blot检测miR-4419a、miR-432和miR-487b表达上调，miR-4417表达下调，结果与芯片结果一致；（4）生物信息学分析结果显示：PKCβ可能为miR-432和miR-199a的靶基因，MCL1可能为miR-4539的靶基因；（5）RT-PCR结果显示：PKCβ表达降低，而其上游的miRNA（miR-432和miR-199a）表达升高，与DGE结果一致；MCL1表达降低，其上游的miRNA（miR-4539）表达升高，与DGE结果一致；（6）Western Blot检测结果显示PKCβ表达降低，MCL1表达降低。结论：（1）获得了中性粒细胞自发性凋亡过程中的mRNA差异表达谱；（2）获得了中性粒细胞自发性凋亡过程中的miRNA差异表达谱，且结果可靠；（3）PKCβ、MCL1可能参与调控中性粒细胞自发性凋亡；（4）miR-432和miR-199a可能通过下调PKCβ的表达参与调节中性粒细胞自发性凋亡；（5）miR-4539可能通过下调MCL1的表达参与调节中性粒细胞自发性凋亡。
【关键词】：中性粒细胞 自发性凋亡 miRNA miR-432 miR-199a miR-4539 MCL1 PKCβ
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 材料与方法12-24
• 结果24-35
• 讨论35-40
• 结论40-41
• 参考文献41-45
• 英汉缩略名词对照表45-46
• 致谢46-47
• 综述47-58
• 参考文献54-58

【参考文献】

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1 冯知涛;李娟;任洁;吕卓;;类风湿关节炎患者外周血miR-146a及miR-16的表达及与病情活动的相关性研究[J];南方医科大学学报;2011年02期

2 张姿,刘佳佳,何延政;中性粒细胞凋亡信号转导途径的研究进展[J];泸州医学院学报;2004年04期

3 薛晓婕;刘佳佳;羊建;段承刚;刘晓燕;谢华福;;凋亡相关基因在ONO-AE-248诱发的中性粒细胞非凋亡性程序化死亡中的表达[J];免疫学杂志;2008年03期

4 薛晓婕;刘佳佳;;ONO-AE-248诱发中性粒细胞非凋亡性程序化死亡中Mcl-1表达的研究[J];免疫学杂志;2011年01期

5 张韶辉;魏广和;刘立新;;MicroRNA研究的基本方法及流程[J];济宁医学院学报;2013年02期

6 杨琼;杨侃;李安莹;谭文鹏;;MicroRNA-21在缺血再灌注损伤早期大鼠心肌的表达及抗细胞凋亡作用[J];中南大学学报(医学版);2013年05期

  本文关键词：中性粒细胞自发性凋亡相关miRNA的鉴定及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：321582