基于EGFR二聚化靶向策略的多肽疫苗构建

发布时间：2017-04-24 22:00

  本文关键词：基于EGFR二聚化靶向策略的多肽疫苗构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是EGFR家族的主要成员之一，在众多上皮源恶性肿瘤细胞表面过表达，是抗肿瘤药物的热门靶点。目前已有针对EGFR的单抗与小分子酪氨酸激酶抑制剂类药物上市，但此类药物临床反应率低（15-25%），其背后主要原因是EGFR分子表面及酪氨酸激酶区域具有高度变异性。又配体结合引起的EGFR之间或EGFR与其他家族成员间的“二聚化”是EGFR下游信号通路激活的关键步骤，参与“二聚化”的界面区是结构上高度保守的区域，因此靶向EGFR二聚体界面区有可能提高抗EGFR类治疗的临床反应率。治疗性疫苗属于主动免疫，给药剂量小，仅需少数几次免疫接种，因此，比抗体类产品更具顺应性。恶性肿瘤治疗性多肽疫苗以肿瘤抗原肽为活性组分，可利用基因工程或化学合成手段低成本生产，具有较好的产业发展前景。本实验室前期工作中分离鉴定了一个来自EGFR的B细胞表位肽——EGFR237-267，基于该B细胞表位肽与一种来自麻疹病毒融合蛋白的Th表位肽MVF所构建的“嵌合肽”，可有效刺激体液免疫反应，并在体内外呈现了一定的抗瘤活性，但此类抗原肽的免疫原性尚有改进空间。P64K是一种来自脑膜炎球菌外膜蛋白的新型载体蛋白，免疫原性强、安全性高、并且可通过基因工程方法高效生产，便于质控。本研究拟在前期工作基础上，构建一系列基于EGFR237-267和P64K及MVF的B细胞表位多肽疫苗，，并通过免疫原性和体内抗瘤活性比较试验筛选、并确定抗原肽最佳构建形式，以便为研制靶向EGFR二聚体界面的多肽疫苗打下基础。 方法： 1.重组抗原MVF-E的制备 将MVF-E质粒导入E.coli BL21(DE3)中表达，产物加入EDTA及PMSF抑制内源性蛋白酶降解，经阴离子交换层析除去降解蛋白，镍离子螯合亲和层析纯化融合蛋白，肠激酶酶切获得小子分抗原肽。 2.化学偶联抗原P64K*E与P64K*MVF-E的制备 大肠杆菌表达系统中诱导表达P64K蛋白，通过Q柱、Source30Q、PEI离子交换柱纯化蛋白，获得纯度为90%以上的载体蛋白。B细胞表位E通过化学合成获得，MVF-E通过方法1获得，将载体蛋白与B细胞表位E以及MVF-E用PBS溶解后，按两者摩尔比比例1:10混合，加戊二醛终浓度0.5%反应，反应时间45min，以0.2mol甘氨酸终止反应，获得偶联产物，Sephadex G-25除去小分子物质，样品冻干备用。 3.重组抗原P64K-E与E-P64K的制备 获得P64K-E与E-P64K质粒，导入大肠杆菌表达系统，以镍离子螯合亲和层析纯化融合蛋白。 4.五种构建形式的抗原肽的免疫原性分析 将60只C57BL/6小鼠随机分成6组，Ⅰ组：佐剂对照组；Ⅱ组：MVF-E组；Ⅲ组：P64K*E组；Ⅳ组：P64K*MVF-E组；Ⅴ组：P64K-E组；Ⅵ组：E-P64K组，初次免疫后每隔两周加强免疫，每次免疫后10天取血，ELISA法检测小鼠血清效价。 5.体内抑瘤活性分析 建立C57BL/6小鼠肺癌模型（LLC）,于小鼠免疫第三次后14天背肩胛部皮下移植肿瘤，观察小鼠肿瘤成瘤情况、生长情况及身体状况，移植肿瘤7天后每隔两天用游标卡尺测量小鼠的肿瘤体积大小，21天后剥离小鼠肿瘤，称重，分析每组疫苗抑瘤情况及小鼠肺转移情况。 结果 1.成功制备五种构建形式MVF-E、P64K*E、P64K*MVF-E、P64K-E和E-P64K的多肽疫苗。 2.五种多肽疫苗均在小鼠身上产生较高滴度的抗体，其中化学偶联形式P64K*E产生的滴度最高，其结果优于融合肽的抗体滴度。而以融合肽形式表达的多肽抗原中，抗体滴度MVF-E＞E-P64K＞P64K-E。 3.比较各组小鼠肿瘤抑制情况，P64K*E、P64K-E和E-P64K组与对照组的肿瘤抑制情况相比具有统计学差异，其中P64K*E组的抑瘤情况最明显。MVF-E与P64K*MVF-E组的抑瘤情况不明显。各组小鼠在21天时均未出现肺转移情况。 结论 确定了基于B细胞表位EGFR237-267的抗原肽最佳构建形式为P64K*E，为进一步研制相关疫苗打下了良好基础。
【关键词】：多肽疫苗 靶向二聚化界面 化学偶联 抗肿瘤
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 第1章 绪论12-18
• 1 前言12
• 2 目前针对 EGFR 过表达恶性肿瘤的靶向治疗及存在的缺陷12-13
• 3 “二聚化靶向”策略13-14
• 4 主动免疫发展概况14-17
• 5 本课题的研究基础及内容17-18
• 第2章 EGFR 二聚化靶向多肽疫苗的设计与制备18-46
• 1 前言18-19
• 2 实验材料19-23
• 2.1 基因模板来源19
• 2.2 菌种和质粒19
• 2.3 引物序列19
• 2.4 主要试剂19-20
• 2.5 主要仪器设备20-21
• 2.6 溶液的配制21-23
• 3 实验方法23-30
• 3.1 重组抗原 MVF-E 的制备23-24
• 3.1.1 MVF-E 基因的获得23
• 3.1.2 MVF-E 蛋白诱导表达23-24
• 3.1.3 MVF-E 表达产物纯化24
• 3.2 化学偶联抗原 P64K*E 与 P64K*MVF-E 的制备24-29
• 3.2.1 多肽片段 E 与 MVF-E 的获得24
• 3.2.2 基因工程方法制备 P64k 载体24-28
• 3.2.3 戊二醛法制备偶联抗原 P64K*E 与 P64K*MVF-E28-29
• 3.3 重组抗原 P64K-E 与 E-P64K 的制备29-30
• 3.3.1 重组蛋白诱导表达29
• 3.3.2 镍柱亲和层析纯化重组蛋白29-30
• 4 实验结果30-43
• 4.1 抗原肽设计30-32
• 4.1.1 重组抗原肽的构建30
• 4.1.2 偶联抗原肽的构建30-32
• 4.2 重组抗原 MVF-E 的制备与鉴定32-36
• 4.2.1 MVF-E 的原核构建表达形式构建32-33
• 4.2.2 MVF-E 的表达形式分析33
• 4.2.3 MVF-E 表达产物的分离纯化与鉴定33-36
• 4.3 化学偶联抗原 P64K*E 与 P64K*MVF-E 的制备36-42
• 4.3.1 PCR 扩增目的基因 P64K 及其鉴定36-37
• 4.3.2 重组 P64K 蛋白表达形式分析37-38
• 4.3.3 P64K 蛋白纯度及收率38-39
• 4.3.4 偶联抗原 P64K*E 与 P64K*MVF-E39-42
• 4.4 重组抗原 P64K-E 与 E-P64K 的获得42-43
• 5 讨论43-45
• 6 小结45-46
• 第3章 抗原肽的免疫原性分析及体内抑瘤活性分析46-61
• 1 前言46
• 2 实验材料46-49
• 2.1 细胞株46
• 2.2 实验动物46-47
• 2.3 主要试剂设备47
• 2.4 主要试剂的配制47-49
• 3 实验方法49-52
• 3.1 分组与给药49
• 3.2 LLC 肺癌皮下移植瘤模型建立49-50
• 3.3 抗原表位肽免疫原性分析50-51
• 3.3.1 小鼠血清的采集50
• 3.3.2 ELISA 检测小鼠血清中的抗体滴度50-51
• 3.4 观察指标51
• 3.4.1 成瘤率及生存情况51
• 3.4.2 肿瘤生长情况51
• 3.4.3 肿瘤瘤重及抑瘤率51
• 3.4.4 肺转移节节点数及主要免疫脏器的影响51
• 3.5 统计学分析51-52
• 4 实验结果52-58
• 4.1 免疫原性分析52-53
• 4.2 致瘤结果53-54
• 4.3 各组小鼠生存质量54-55
• 4.4 肿瘤体积及生长曲线55-56
• 4.5 肿瘤的瘤重及抑瘤率56-58
• 4.6 小鼠肺转移情况58
• 5 讨论58-60
• 6 小结60-61
• 第4章 结论61-62
• 参考文献62-68
• 攻读硕士学位期间所发表的论文专利及科研成果68-69
• 附录1 文献综述69-78
• 参考文献74-78
• 附录2 英文缩写词表78-80
• 附录3 核酸及氨基酸序列80-86
• 致谢86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 何颖,张尚权,赵峰,吴振华,王耀发,严缘昌;表皮生长因子受体单抗导向药物(EQ75-ADR)的制备及对人表皮癌抑瘤作用的研究[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2000年02期

  本文关键词：基于EGFR二聚化靶向策略的多肽疫苗构建，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：325020