新疆出血热病毒M、S基因DNA疫苗的免疫效果及糖蛋白抗原表位的初步分析

发布时间：2017-04-25 11:12

  本文关键词：新疆出血热病毒M、S基因DNA疫苗的免疫效果及糖蛋白抗原表位的初步分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：克里米亚刚果出血热(Crimean—Congo hemorrhagic fever，CCHF)是CCHF病毒引起的一种蜱传出血热传染病，病死率高达50％，分布在世界三十多个国家，已成为危害人类身体健康的重要传染病之一。在我国于1965年分离得到该病毒，又称新疆出血热病毒(Xinjiang hemorrhagic fever，XHFV)，目前已分离到多株病毒,但一直未得到对其切实有效的诊断方法及治疗手段。XHFV S基因编码核蛋白（nucleoprotein，NP）是病毒诱导机体发生免疫反应的主要抗原，而M基因编码的糖蛋白（glycoproteins，GP）在CCHFV的感染与致病过程中起着重要作用。因此，研究XHFV核蛋白NP及糖蛋白GP（包括Gn，Gc）片段的抗原性和免疫原性对于加快我国XHFV诊断技术和疫苗的研究具有重要推动作用。本研究构建了XHFVS和M基因重组DNA疫苗并检测了其免疫效果；同时，利用改良生物合成肽法将XHFV79121株糖蛋白Gc片段的截短的16肽基因构建到原核表达载体pXXGST-1上进行诱导表达，用制备的抗XHFV糖蛋白兔多抗对多肽进行抗原活性的免疫印迹(Western Blot)分析，确定了Gc上可能存在的抗原表位。本研究主要取得了以下结果： 1.为筛选XHFV核蛋白（NP）的优势抗原表位，通过诱导表达及纯化获得YL04057株的6种融合蛋白NP（aa1-482）、NP2（aa170-305）、NP2-（caa235-305）、NP2-c-1（aa237-256）、NP2-c-2（aa250-265）、NP2-c-3（aa260-276），分别用重组蛋白对羊血清进行间接ELISA法检测，以间接免疫荧光法（IFAT）检测结果为参照标准进行对比，结果发现，NP2蛋白的敏感性为73.3%，特异性为100%，总符合率为87.9%，NP2-c蛋白的敏感性为66.7%，特异性为94.4%，总符合率为81.8%。结果表明NP2和NP2-c的抗原性较强，提示这两种抗原可以作为研发新型XHF诊断试剂的候选抗原表位。 2.选取YL04057株核蛋白全长NP（1-482aa）及抗原性较强的基因片段NP2（170-305aa）与糖蛋白（Gn，Gc）基因片段，分别或嵌合构建至真核表达载体PVAX1上，获得5种重组质粒：pVAX1-NP，pVAX1-NP2，pVAX1-Gn，pVAX1-Gc及pVAX1-Gc-NP2。以pVAX1为对照组，分别用空载体和重组质粒免疫Balb/c小鼠，并用ELISA法、淋巴细胞增殖实验以及细胞因子水平的检测基因免疫小鼠后产生的应答效果。结果显示，pVAX1-NP2组鼠的血清抗体效价能够达到1：6400；pVAX1-NP2及pVAX1-Gc-NP2组与对照组相比，小鼠脾脏T淋巴细胞增殖效果明显（P0.01），这两个实验组的IFN-γ表达水平也很高，可以达到865.15pg/mL及1727.205pg/mL，与对照组相比具有极显著的差异(P0.01)；pVAX1-NP2及pVAX1-Gn组IL-4的表达水平为19.11pg/mL和20.07pg/mL，与对照组的9.35pg/mL相比也有显著差异(P0.05)。pVAX1-NP2及pVAX1-Gc-NP2实验组效果最好，提示这两个重组基因片段可作为XHFV的候选DNA疫苗。 3.对XHFV79121株糖蛋白（Gc）氨基酸序列进行生物信息学分析，以α螺旋，β折叠，转角，疏水性，松散型及B细胞线性抗原表位的预测等多项指标设计10个含有预测抗原表位的16肽，合成后分别构建至pXXGST-ST载体上。为制备兔抗多克隆抗血清，将YL04057株编码糖蛋白M基因C端截短成Gc1及Gc2基因片段，构建至pET-28a原核表达载体，并诱导表达纯化制备兔抗Gc1及Gc2多克隆抗体。利用多抗通过Western blot法对重组表达的16肽进行抗原性分析，结果显示，其中6个16肽能够与抗血清特异性结合，表明获得了6个具有抗原表位的多肽（Gc116-131，Gc228-243，Gc362-377，，Gc370-385，Gc505-520，Gc513-528）。通过保守性分析，发现首次鉴定出的XHFV糖蛋白的6个抗原表位具有较强的保守性（达到81.25%以上），这为XHFV检测试剂盒及表位肽疫苗的研制提供了基础资料。
【关键词】：新疆出血热病毒 S基因 M基因 基因疫苗 核蛋白 糖蛋白 抗原表位
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 文献综述12-29
• 1 XHF 的检测、治疗和疫苗研究概况12-16
• 1.1 XHF 的检测12-14
• 1.2 XHF 的治疗14-15
• 1.2.1 一般治疗措施14
• 1.2.2 利巴韦林14
• 1.2.3 抗体治疗14-15
• 1.2.4 其他抗病毒治疗15
• 1.3 XHF 的疫苗15-16
• 2 XHF 核蛋白结构及功能特点16-17
• 3 XHF 糖蛋白结构及功能特点17-19
• 4 M 基因进化树及遗传特异性19-21
• 5 病毒抗原表位的基本研究方法21-23
• 5.1 抗原表位的分类21
• 5.2 病毒抗原表位的预测方法21-22
• 5.3 抗原肽的合成方法22
• 5.4 病毒抗原表位的筛选、鉴定方法22-23
• 参考文献23-29
• 第二章 新疆出血热病毒核蛋白优势表位抗原的筛选29-41
• 摘要29
• 前言29-30
• 1 材料和试剂30-32
• 1.1 材料30-31
• 1.2 试剂31-32
• 1.2.1 主要试剂31
• 1.2.2 主要溶液配方31-32
• 2 研究方法32-34
• 2.1 XHFV NP 蛋白及其截短蛋白的的诱导表达32
• 2.2 原核表达融合蛋白的纯化32-34
• 2.2.1 His 标签蛋白的纯化32-33
• 2.2.2 GST 标签蛋白的纯化33
• 2.2.3 PAGE 胶蛋白微量回收33
• 2.2.4 Bradford 法测量蛋白浓度33-34
• 2.3 间接 ELISA 法筛选优势抗原表位34
• 3 结果与分析34-39
• 3.1 重组蛋白的诱导及纯化34-35
• 3.2 间接 ELISA 实验结果35-39
• 4 讨论39-40
• 参考文献40-41
• 第三章 重组新疆出血热病毒 S 和 M 基因疫苗的构建及免疫效果41-59
• 摘要41
• 引言41-42
• 1 材料和试剂42-45
• 1.1 材料42-43
• 1.2 试剂43-45
• 1.2.1 主要试剂43
• 1.2.2 培养基和主要溶液配方43-45
• 2 方法45-52
• 2.1 病毒总 RNA 的提取45-46
• 2.2 DNA 疫苗的构建与鉴定46-49
• 2.2.1 S, M 基因的克隆与鉴定46-47
• 2.2.2 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备47
• 2.2.3 重组真核质粒的转化和筛选：47-48
• 2.2.4 重组质粒的大量提取及纯化48-49
• 2.3 小鼠免疫49-50
• 2.4 MTT 法检测淋巴细胞增殖50
• 2.5 细胞因子 IFN-γ,IL-4 水平的检测50-51
• 2.6 ELISA 法检测小鼠血清中抗体效价51
• 2.7 Western Blotting 检测51-52
• 2.8 统计学分析52
• 3 结果与分析52-56
• 3.1 重组质粒的酶切及 PCR 鉴定52-53
• 3.2 脾 T 淋巴细胞增殖反应分析53-54
• 3.3 细胞因子水平的检测结果54-55
• 3.4 小鼠血清的抗体水平检测结果55-56
• 3.5 Western blot 分析抗体的特异性56
• 4 讨论56-57
• 参考文献57-59
• 第四章 新疆出血热病毒 M 基因编码蛋白分段表达及其抗原性的初步研究59-81
• 摘要59
• 引言59-60
• 1 材料和试剂60-61
• 1.1 材料60-61
• 1.2 主要试剂61
• 2 研究方法61-67
• 2.1 Gc1 和 Gc2 蛋白的表达，纯化及多克隆抗体的制备61-63
• 2.1.1 原核表达载体的构建61
• 2.1.2 r-Gc1，r-Gc2 融合蛋白的优化表达及纯化61-62
• 2.1.3 兔抗 rGc1，rGc2 多克隆抗体的制备62
• 2.1.4 多克隆抗体效价的测定62-63
• 2.2 XHFV Gc 蛋白生物信息学分析63
• 2.3 改良生物合成肽策略63-64
• 2.4 XHFV Gc 蛋白 16 肽融合蛋白表达载体的构建64-66
• 2.5 XHFV Gc 蛋白 16 肽融合蛋白的表达66-67
• 2.6 Western blot 检测67
• 3 结果67-77
• 3.1 Gc 蛋白的生物信息学分析67-68
• 3.2 pET-28a-Gc1 及 pET-28a-Gc2 原核表达载体的构建和鉴定68
• 3.3 r-Gc1，r-Gc2 融合蛋白的优化表达及纯化68-71
• 3.4 抗 rGc1，rGc2 多克隆抗体的滴度测定71-72
• 3.5 Western blot 分析抗体的特异性72-73
• 3.6 16 肽的诱导表达73
• 3.7 Western blot 分析 16 肽的抗原性73-74
• 3.8 16 肽抗原表位的保守性分析74-77
• 4 讨论77-79
• 参考文献79-81
• 附录81-82
• 个人简介82-83
• 致谢83

【参考文献】

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本文编号：326210