基因重组人源基质细胞衍生因子1α的色谱分离纯化

发布时间：2017-04-25 11:19

  本文关键词：基因重组人源基质细胞衍生因子1α的色谱分离纯化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血管生长影响着多种疾病的生理病理过程,如临床上可检测到的实体瘤的生长、转移以及近十几年患病率逐年增高的心脑血管疾病等都有依赖于血管生长过程。目前,尽管人们已经开发了不少能直接刺激血管的促血管生成因子,如VEGF、FGF、 Angiopoietin-I和Angiogenin等,但由于它们都可能会引起经一氧化氮介导的低血压、血管畸形以及血管通透性增加和渗漏等,致使无法对它们进行新药开发或应用研究。而基质细胞衍生因子la (stromal cell-derived factor-1α, SDF-1α)是1994年Nagasawa等在小鼠骨髓基质细胞系pA6分泌的细胞因子中发现的一种趋化因子,它可以通过间接影响骨髓来调节造血过程从而减少直接作用药物的缺陷,并通过对人体内部刺激因子的调节来进行更加有效地治疗。尽管它不能直接促进血管新生,但可以聚集具有促血管新生作用的多种细胞到缺血局部。因此,SDF-1α是一种潜在的治疗心肌缺血、脑缺血性以及溃疡等疾病的药物。 本文在我们前期工作的基础上,对基因重组人源基质细胞衍生因子1α的分离纯化过程进行了研究。结果表明,重组菌E.Coli BL21(DE3)/pET15b-SDF-1α经发酵培养、破菌和包涵体复性后,经过SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换和Sephadex G-75凝胶排阻两步柱层析分离纯化,可以得到具有生物活性和高纯度的SDF-1α。SDS-PAGE蛋白电泳和高效凝胶色谱分析结果表明,所得到的SDF-1α的纯度在96%以上；单核细胞THP-1的Transwell细胞小室培养结果表明,所得到的SDF-1α对THP-1细胞具有趋化活性。经两步柱层析分离纯化后,SDF-1α的收率约为14%。
【关键词】：基质细胞衍生因子1α 分离纯化 阳离子交换层析 凝胶排阻层析
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363;Q81
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 绪论8-13
• 1.1 血管生长药物及其缺陷8-9
• 1.2 SDF-19-11
• 1.2.1 SDF-1的趋化能力9-10
• 1.2.2 SDF-1的间接治疗作用10
• 1.2.3 SDF-1与心肌缺血10
• 1.2.4 SDF-1与脑缺血性疾病10-11
• 1.2.5 SDF-1与肿瘤11
• 1.3 本研究的目的及意义11-13
• 第二章 重组蛋白SDF-1α菌种的重培养13-17
• 2.1 实验思路13
• 2.2 实验材料13-14
• 2.2.1 菌种与质粒13-14
• 2.2.2 试剂14
• 2.2.3 仪器设备14
• 2.2.4 培养基及主要试剂配制14
• 2.3 实验方法14-15
• 2.3.1 重组蛋白SDF-1α菌种的复壮14
• 2.3.2 质粒的提取14-15
• 2.3.3 转化15
• 2.4 实验结果及讨论15-16
• 2.5 本章小结16-17
• 第三章 SDF-1α的诱导表达和分离纯化17-33
• 3.1 实验思路17-23
• 3.1.1 工程菌的诱导表达17-18
• 3.1.2 层析方法的选择18-22
• 3.1.2.1 离子交换层析18-21
• 3.1.2.2 凝胶排阻层析21-22
• 3.1.3 蛋白电泳22-23
• 3.2 实验材料23-25
• 3.2.1 菌种及层析柱23
• 3.2.2 实验试剂23
• 3.2.3 仪器设备23
• 3.2.4 培养基及主要试剂配制23-25
• 3.3 实验方法25-28
• 3.3.1 冷冻菌种培养、诱导表达25
• 3.3.2 菌体破碎25
• 3.3.3 变性和复性25-26
• 3.3.4 SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换26
• 3.3.5 凝胶排阻26
• 3.3.6 脱盐和冻干26-27
• 3.3.7 蛋白电泳27-28
• 3.4 实验结果与讨论28-32
• 3.4.1 SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换结果28-29
• 3.4.2 凝胶排阻结果29-30
• 3.4.3 蛋白电泳结果30-32
• 3.4.3.1 重组菌E.Coli BL21(DE3)/pET15b-SDF-1α的表达30-31
• 3.4.3.2 两步层析分离的电泳检测31-32
• 3.5 本章小结32-33
• 第四章 重组蛋白SDF-1α的检测33-40
• 4.1 实验思路33-34
• 4.1.1 纯度和浓度33
• 4.1.2 活性33-34
• 4.2 实验材料34-35
• 4.2.1 细胞和试剂34
• 4.2.2 仪器设备34
• 4.2.3 培养基及试剂配制34-35
• 4.3 实验方法35-36
• 4.3.1 SDS-PAGE蛋白电泳和高效凝胶色谱35
• 4.3.2 Bradford法测量蛋白浓度35
• 4.3.3 Transwell细胞小室实验35-36
• 4.4 实验结果与讨论36-39
• 4.4.1 SDF-1α的分离纯化结果36-37
• 4.4.2 重组SDF-1α的活性鉴定结果37-39
• 4.5 本章小结39-40
• 结论40-41
• 参考文献41-49
• 致谢49

【参考文献】

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本文编号：326242