胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中蛋白糖基化变化的研究

发布时间：2017-04-26 21:02

  本文关键词：胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中蛋白糖基化变化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)具有多潜能性及自我更新的能力,对于研究细胞分化而言是一类十分有效的材料。与ESCs相似,孤雌胚胎干细胞(parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs)同样具有这些特性,ESCs与pESCs均具有向脂肪细胞分化的潜能,因此研究胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程的分子机制对治疗肥胖相关疾病至关重要。近年来,胚胎干细胞向脂肪细胞分化的过程已在基因和蛋白水平被广泛研究,但其过程中蛋白糖基化的变化尚不清楚。实验目的： 研究胚胎干细胞(ESCs)J1和孤雌胚胎干细胞(pESCs)向脂肪细胞分化过程中蛋白糖基化的变化情况并比较其差异。方法和结果： 1.通过细胞形态学观察,免疫荧光检测干细胞标志蛋白(OCT4,NANOG,SSEA-1)的表达,畸胎瘤形成及细胞活力(wst-1),比较J1ESCs和pESCs在体内、外分化潜能及细胞增殖活性。结果显示,J1ESCs和pESCs均保持高度的全能性,细胞增殖能力无显著性差异(p0.05)。 2.通过茜素红、番红O、油红O染色及RT-PCR检测骨细胞(ocn和alp)、软骨细胞(agg和col Ⅱ)、脂肪细胞(ppar γ和fabp4)特异性基因的表达,研究J1ESCs和pESCs成骨、成软骨及成脂能力。结果显示,J1ESCs和pESCs均具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的潜能。 3.通过油红O染色阳性率、免疫荧光检测脂肪细胞特异性蛋白(C/EBP α和FABP4)的表达、qPCR检测脂肪细胞特异性基因(ppar γ, fabp4和c/ebp α)及干细胞特异性基因(oct4)的表达水平,比较J1ESCs和pESCs向脂肪细胞分化的能力。结果显示,诱导20d后,J1ESCs和pESCs油红O细胞阳性率分别为60%±6.4%和42%±6.9%(p0.05),C/EBP α和FABP4蛋白在pESCs诱导5d后均不表达,而在J1ESCs诱导5d后均表达阳性。ppar γ, fabp4和c/ebp α基因在J1ESCs向脂肪诱导过程中变化倍数均显著高于pESCs(p0.05).oct4在ESCs和pESCs中表达量均显著下降(p0.05)。 4.通过凝集素芯片技术及凝集素组化技术比较J1ESCs和pESCs在脂肪诱导过程中蛋白糖基化的变化。结果显示,在37种凝集素中,诱导第20d, J1ESCs和pESCs中有21种凝集素展现出相同的变化,其中7种上升,12种下降,2种无显著变化。37种凝集素中,两种胰岛素样活性凝集素在J1ESCs和pESCs中表现出不同的变化趋势。诱导后,WGA(识别多价唾液酸和G1cNAc)在J1ESCs和pESCs中均上调,ConA(识别分支和末端的甘露糖及末端的G1cNAc)的信号值在J1ESCs中上调,在pESCs中下调。凝集素组化结果中WGA和ConA表现出相同的结果。四种识别甘露糖结构的凝集素NPA, HHL, GNA和ConA在J1ESCs和pESCs中展现不同的变化趋势,NPA和HHL(识别α-1,6甘露糖)的信号值在J1ESCs和pESCs中均下调；GNA(识别末端α-1,3甘露糖)的信号值在pESCs中下调,在J1ESCs中无显著变化(p0.05)。对糖基转移酶Alg12和Alg3的实时定量分析结果显示,Alg12(α-1,6甘露糖基转移酶)在ESCs和pESCs中均下调,Alg3(α-1,3甘露糖基转移酶)只pESCs中下调,在J1ESCs中无显著变化,这与凝集素芯片的结果是一致的。Alg3和Alg12的表达水平影响N-聚糖前体的合成。证明N-聚糖前体的合成在脂肪生成过程中存在下调。结论： J1ESCs和pESCs均具有高度全能性,具有向骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞分化的能力,但pESCs的成脂能力较弱。向脂肪诱导分化过程中,J1ESCs和pESCs糖链有明显的变化且十分相似,G1cNAc结构含量上升和α-1,2-岩藻糖基化水平上调,α-1,6岩藻糖基化水平,α-2,6唾液酸化水平和α-1,6甘露糖基化水平下调。但在该过程中也存在着明显的不同,α-1,3甘露糖基化水平(GNA和Alg3)只在pESCs下调,在J1ESCs中无显著变化。
【关键词】：胚胎干细胞 孤雌胚胎干细胞 脂肪生成 凝集素芯片 糖基化
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【目录】：

• ~.略语表3-5
• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 文献综述13-23
• 1 脂肪生成(Adipogenesis)13-15
• 2 胚胎干细胞(ESCs)研究进展15-17
• 2.1 胚胎干细胞15-16
• 2.2 孤雌胚胎干细胞(pESCs)16-17
• 3 糖组学研究进展17-18
• 4 糖芯片技术研究进展18-21
• 4.1 凝集素芯片技术18-21
• 4.2 糖基转移酶芯片技术21
• 5 本实验的设计与意义21-23
• 正文23-62
• 第一部分 胚胎干细胞(ESCs)及孤雌胚胎干细胞(pESCs)的培养及基本特性检测23-31
• 1 材料23-24
• 1.1 细胞来源及实验动物23
• 1.2 主要试剂与耗材23
• 1.3 主要仪器23-24
• 1.4 主要试剂配制24
• 2 方法24-26
• 2.1 ESCs和pESCs的培养24-25
• 2.2 拟胚体的制备25
• 2.3 免疫荧光检测胚胎干细胞全能性25-26
• 2.4 畸胎瘤形成实验26
• 2.5 细胞增殖能力检测26
• 3 实验结果26-29
• 3.1 ESCs及pESCs的形态学观察及比较26-27
• 3.2 胚胎干细胞及孤雌胚胎干细胞体外检测27-28
• 3.3 胚胎干细胞及孤雌胚胎干细胞体内检测28
• 3.4 胚胎干细胞及孤雌胚胎干细胞细胞增殖的比较28-29
• 4 讨论29-30
• 5 小结30-31
• 第二部分 胚胎干细胞(ESCs)及孤雌胚胎干细胞(pESCs)的三系分化能力31-40
• 1 材料31-32
• 1.1 细胞来源31
• 1.2 主要试剂31
• 1.3 主要仪器31-32
• 1.4 主要试剂配制32
• 2 方法32-35
• 2.1 胚胎干细胞及拟胚体的培养32
• 2.2 间充质样干细胞的获得32
• 2.3 成骨诱导32
• 2.4 软骨诱导32
• 2.5 脂肪诱导32-33
• 2.6 条件培养基诱导培养下相关基因表达的检测33-35
• 2.7 茜素红染色35
• 2.8 番红O染色35
• 2.9 油红O染色35
• 3 实验结果35-38
• 3.1 胚胎干细胞三系分化形态学的观察35-37
• 3.2 胚胎干细胞三系分化基因水平检测37-38
• 4 讨论38-39
• 5 小结39-40
• 第三部分 胚胎干细胞(ESCs)及孤雌胚胎干细胞(pESCs)向脂肪细胞分化的研究40-49
• 1 材料40-41
• 1.1 细胞来源40
• 1.2 主要试剂40
• 1.3 主要仪器40-41
• 2 方法41-42
• 2.1 胚胎干细胞向脂肪细胞的诱导步骤41
• 2.2 实时定量(real time)PCR检测41-42
• 2.3 油红O阳性率统计42
• 3 实验结果42-46
• 3.1 胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中形态学的观察42-44
• 3.2 胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中蛋白水平的检测44
• 3.3 胚胎干细胞向脂肪细胞分化过程中基因水平的检测44-46
• 4 讨论46-47
• 5 小结47-49
• 第四部分 胚胎干细胞(ESCs)及孤雌胚胎干细胞(pESCs)在向脂肪细胞分化过程中蛋白糖基化变化的研究49-62
• 1 材料49-50
• 1.1 细胞来源49
• 1.2 主要试剂49-50
• 1.3 主要仪器50
• 2 方法50-52
• 2.1 胚胎干细胞培养及向脂肪细胞的分化50
• 2.2 总蛋白的提取50
• 2.3 凝集素芯片制备50
• 2.4 蛋白样本的标记与孵育50-51
• 2.5 凝集素芯片结果获取与分析51
• 2.6 凝集素组化51
• 2.7 实时定量pcr检测糖基转移酶表达水平51-52
• 3 实验结果52-56
• 3.1 凝集素芯片实验结果52-53
• 3.2 凝集素组化检测糖链在细胞中的分布53-56
• 3.3 糖基转移酶实时定量pcr检测结果56
• 4 讨论56-57
• 5 小结57-62
• 全文总结62-64
• 参考文献64-72
• 致谢72

【共引文献】

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1 夏广军;金鑫;田万年;金海国;严昌国;;延边黄牛甲状腺球蛋白基因的SNPs及其与生长性状的关联分析[J];中国畜牧兽医;2014年03期

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3 李一帆;柠檬精油经嗅觉通路对DXM肥胖小鼠体重影响研究[D];安徽医科大学;2013年

4 王文杰;Pygo2通过Wnt信号通路抑制脂肪分化的分子机制[D];厦门大学;2014年

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本文编号：329207