大鼠真核表达载体pcDNA3.1（+）/GPC3N 48 -EGFP-GPC3C 550 的构建及鉴定

发布时间：2021-07-23 01:31

　　目的：从大鼠胎肝组织克隆GPC3基因,成功构建带绿色荧光蛋白报告基因的大鼠真核表达载体pcDNA3.1（+）/GPC3N48-EGFP-GPC3C550,为深入研究GPC3的功能和应用奠定基础。方法：①根据已知的大鼠GPC3基因序列,设计相关引物,分析pGEM-T质粒、骨架质粒pcDNA3.1（+）和pGEM-T/EGFP质粒的酶切位点,在相应引物两端引入适合的限制性内切酶位点。②提取大鼠胎肝组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增包含全长GPC3的基因片段,连入pGEM-T载体,经过蓝白筛选,挑细菌克隆。经菌液PCR及测序鉴定,得到pGEM-T/RGPC3-Long质粒。③以pGEM-T/GPC3R-Long质粒为基础,应用相应的引物依次构建带有全长GPC3基因的pGEM-T/GPC3ORF质粒、截短的GPC3-N端pGEM-T/GPC3N48质粒和GPC3-C端pGEM-T/GPC3C550质粒。④上述质粒和已保存的pGEM-T/EGFP质粒,经双酶切、连接和转化,依次将基因片段GPC3-N48、EGFP和GPC3-C550插入到pcDNA3.1（+）中,构建带有绿色荧光蛋白的大鼠真... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
Abstract
摘要
目录
符号说明
1 前言
2 材料和方法
    2.1 标本来源
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验试剂与试剂盒
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 引物设计与合成
    2.3 实验方法
        2.3.1 pGEM-T/GPC3 R-Long表达载体的构建及鉴定
        2.3.2 pGEM-T/GPC3R ORF表达载体的构建及鉴定
        2.3.3 截短型pGEM-T/GPC3N_(48)和pGEM-T/GPC3C_(550)表达载体的构建及鉴定
        2.3.4 pcDNA3.1(+)/GPC3N_(48)-EGFP-GPC3C_(550)的嵌合
3 实验结果
    3.1 pGEM-T/GPC3 R-Long表达载体
        3.1.1 总RNA的提取
        3.1.2 RT-PCR结果
        3.1.3 蓝白斑筛选结果
        3.1.4 菌液PCR验证
        3.1.5 测序分析
    3.2 pGEM-T/GPC3 ORF表达载体
        3.2.1 PCR结果
        3.2.2 菌液PCR验证
        3.2.3 测序分析
    3.3 截短型pGEM-T/GPC3N_(48)和pGEM-T/GPC3C_(550)表达载体
        3.3.1 PCR结果
    3.4 真核表达载体pcDNA3.1(+)/GPC3N_(48)-EGFP-GPC3C_(550)的嵌合
        3.4.1 pcDNA3.1(+)/GPC3C_(550)载体的构建和酶切鉴定
        3.4.2 pcDNA3.1(+)/GPC3 N_(48)-EGFP-GPC3C_(550)的鉴定
4 讨论
5 结论
本课题创新性研究以及不足
参考文献
综述
    参考文献
致谢



本文编号：3298312