CIB1在VEGF诱导的MSCs成血管分化过程中的作用研究

发布时间：2017-04-27 06:07

本文关键词：CIB1在VEGF诱导的MSCs成血管分化过程中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 1.人脐带间充质干细胞的分离培养和鉴定。 2. CIB1在VEGF诱导的MSCs成血管分化过程中的作用研究。方法： 1．取剖宫产足月新生儿脐带，在无菌超净工作台中采用组织贴壁法分离提取原代hUC-MSCs用0.25%胰蛋白酶消化、传代，利用流式细胞术对hUC-MSCs的免疫表型和周期进行检测，取第3-5代细胞进行实验。同时进行成脂肪细胞的诱导分化。 2．本实验以hUC-MSCs为对象，应用构建好的CIB1慢病毒载体对其进行转染，实验分四组，正常hUC-MSCs诱导组；CIB1慢病毒载体转染hUC-MSCs诱导组，此组又分为NC感染诱导组、pGV-siCIB1感染诱导组；空白对照组，，即正常hUC-MSCs空白对照。首先，进行合理的实验设计分组确定最适的慢病毒感染复数MOI。采用MTT的实验方法观察CIB1慢病毒载体转染hUC-MSCs后细胞的增殖情况，流式细胞仪对各组实验细胞的生长周期进行获取。应用基质胶上三维血管形成实验和Dil-ac-LDL的吸收实验使各组细胞的成血管能力得以检测，最后应用细胞爬片的免疫荧光技术对血管内皮细胞的标志物CDH5、CD34和FLK-1的基因表达进行鉴定。结果： 1.成功分离提取hUC-MSCs，流式细胞仪测定发现其几乎全部都处于分化前阶段，可以很好分化生长。细胞表面标记测定发现hUC-MSCs高表达CD29，阳性率达92.62㳠；高表达CD44和CD105，阳性率分别为88.83㳠和91.87㳠；高表达CD130，92.45㳠； CD45低表达，1.46㳠，低表达HLA-DR，2.06㳠。对其多想分化能力进行测定，发现其可以分化为脂肪细胞，油红O染色阳性，并表达该细胞特定的细胞标志LPL和Leptin。 2.成功地对CIB1抑制表达的慢病毒载体感染hUC-MSCs的MOI进行测定，最适MOI为20。完成感染以后细胞周期以及细胞生存活性的检测，发现感染后G2/M期pGV-siCIB1感染组细胞所占比例较NC感染组明显升高。说明RNAi下调CIB1表达使细胞阻滞在G2/M期。MTT结果显示，pGV-siCIB1感染组细胞的生存活性明显下降，NC感染组变化不明显。进行成血管内皮细胞的条件诱导21天发现，随着时间延长其类似于血管内皮细胞样的管腔结构明显增加，到21天时几乎布满显微镜下整个视野，在基质胶上同样也出现三维的管腔结构，对乙酰标记的人低密度脂蛋白的吸收以较诱导前大幅度增大，同时血管内皮细胞的表面标记CD34、CDH5和FLK-1与诱导前的阴性结果不一样，出现阳性表达。不但形态与血管内皮细胞一样，其细胞活性以及细胞表面表达的标记都与血管内皮细胞一致。而CIB1抑制表达组则不会发生上述变化，既没有管腔结构的出现，也不表达小血管内皮细胞标记CD34，血管内皮细胞标记CDH5和FLK-1。对Dil-ac-LDL的吸收也没有增加。空载体组诱导后实验结果过与正常hUC-MSCs诱导后的结果几乎一致，证明了CIB1在hUC-MSCs在分化为血管内皮细胞的过程中起了重要的作用。结论： 1．成功提取分离人脐带间充质干细胞并对其表型进行鉴定分析，为后期实验做准备。 2．CIB1在VEGF诱导MSCs成血管分化中分子通道上起着重要的作用。
【关键词】：人脐带间充质干细胞 血管内皮细胞生长因子 CIB1 血管分化
【学位授予单位】：青海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
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