抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗的研究

发布时间：2017-04-27 07:08

  本文关键词：抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在烧伤患者中绿脓杆菌的检出率高居各种感染菌首位,绿脓杆菌所产生的致死性毒素绿脓杆菌外毒素A(PEA)是引起患者死亡的主要原因。现有的针对PEA的治疗方法主要分为主动免疫和被动免疫两种形式,但应用异源动物血清治疗,可能造成严重过敏反应,加之绿脓杆菌具有天然耐药性以及广谱抗生素的泛滥使用,使得多重耐药绿脓杆菌感染的情况日益严重。 PEA毒素具有受体结合区、越膜区和毒性区,毒素由受体结合区与细胞表面广泛存在的受体结合,通过越膜区将毒性区转入细胞内发挥ADP核糖基化酶作用,使EF-2发生ADP核糖基化,失活EF-2,阻止细胞蛋白质合成,造成细胞死亡和组织、器官衰竭。所以抑制毒素与受体结合是保护细胞的重要环节。 热休克蛋白(HSP)是一种高度保守且具有分子伴侣功能的应激性蛋白,同时具有增强免疫的生物学特性：通过模式识别受体激活效应细胞产生应答反应。 因此本研究利用基因工程手段将PEA中序列高度保守、免疫原性突出的受体结合亚基与结核杆菌HSP65融合表达,经发酵罐高密度发酵并层析纯化获得融合蛋白HSP65-PEA,作为免疫原对实验动物进行免疫,经小鼠攻毒保护性实验,进行免疫效果评估。同时建立多克隆和单克隆ELISA抗体检测方法及鼠、兔抗体水平的ELISA检测方法。 结果证明重组蛋白HSP65-PEA在大肠杆菌中获得高效表达,纯化获得纯度为95%以上的重组蛋白,用其免疫后小鼠能够产生足量滴度的保护性抗体,保护动物耐受PEA毒素攻击,在机体中可以产生对抗PEA毒素的能力,以5、10倍LD50致死剂量的天然精致PEA毒素攻击小鼠,同时ELISA检测抗体滴度,结果显示无佐剂组产生抗体滴度高于弗氏佐剂组和铝盐佐剂组,其攻毒保护率达到70-100%,证明该融合蛋白HSP65-PEA作为免疫原产生的抗体具备了保护PEA毒素攻击的能力,充分达到实验预期目的。 综上所述,构建获得的高效融合表达蛋白HSP65-PEA具有很强的免疫原性,能够刺激机体产生高滴度的中和抗体,在体内中和感染的PEA毒素,防止毒素的侵袭和细胞毒性作用,同时证明结核杆菌HSP65可以作为自体佐剂,发挥抗原提呈和加强作用,抗体水平优于外来佐剂,避免了外来佐剂的不良反应,大大提高了蛋白的安全性。
【关键词】：PEA HSP65 纯化 攻毒保护
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R644;R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 目录7-9
• 前言9-11
• 第一篇 文献综述11-21
• 第一章 绿脓杆菌的研究概况11-18
• 1.1 绿脓杆菌简介11
• 1.2 绿脓杆菌对人和畜禽的致病性11-12
• 1.3 绿脓杆菌外毒素A(PEA)及其分子结构12-14
• 1.4 绿脓杆菌外毒素A的作用机理14-16
• 1.5 绿脓杆菌外毒素A的应用16-18
• 第二章 热休克蛋白的研究概况18-21
• 2.1 热休克蛋白(HSP)简介18-19
• 2.2 HSP的生物学功能19-21
• 第二篇 研究内容21-47
• 第一章 HSP65-PEAⅠ基因构建及表达21-30
• 1.1 材料与方法21-26
• 1.2 结果26-29
• 1.3 讨论29
• 1.4 小结29-30
• 第二章 工程菌PEAⅠ、HSP65-PEAⅠ发酵及融合蛋白纯化30-36
• 1.1 材料与方法30-33
• 1.2 结果33-34
• 1.3 讨论34-35
• 1.4 小结35-36
• 第三章 抗PEAⅠ单克隆抗体、多克隆抗体标准品制备36-42
• 1.1 材料方法36-38
• 1.2 结果38-40
• 1.3 讨论40-41
• 1.4 小结41-42
• 第四章 小鼠经HSP65-PEAⅠ免疫后攻毒保护性试验42-47
• 1.1 材料和方法42-43
• 1.2 结果43-45
• 1.3 讨论45
• 1.4 小结45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 附录A53-58
• 附录B58-59
• 作者简介59-60
• 致谢60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 凌明圣;徐明波;姚志建;;分子伴侣HSP70研究进展[J];国外医学(分子生物学分册);1993年05期

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3 高玲美,牛钟相,李雅林,丁淑燕;抗绿脓杆菌外毒素A酶标抗体的制备及其应用[J];中国预防兽医学报;2005年01期

4 万忠海,何畅,江禹,甄勇,刘晓明,朱平;重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白动物免疫保护试验[J];中国兽医学报;2001年04期

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  本文关键词：抗烧烫伤感染多器官衰竭绿脓杆菌毒素疫苗的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：330137