高产纳豆激酶生产菌株筛选及应用研究

发布时间：2017-04-27 08:13

  本文关键词：高产纳豆激酶生产菌株筛选及应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本论文从高产纳豆激酶生产菌株的筛选、纯种发酵以及混合发酵等方面开展应用基础研究。 首先，整合纤溶酶活性分离法和纳豆激酶基因扩增法准确快速地筛选出一株高产纳豆激酶生产菌株B. subtilis BN-05（纳豆激酶的活性为2647.19IU/g），并应用生理生化和16S rDNA分子鉴定进行验证。 其次，选用富含γ-GABA发芽大豆为（γ-GABA含量为233.56mg/100g干基）发酵底物优化产纳豆激酶(NK)的发酵条件。在单因素预试验的基础上，先采用Plackett-Burman法筛选影响发酵的主要因素，，分别为发酵温度、接种量和Mg2+的添加量，再通过中心组合设计方法，建立了产酶回归模型，确定了模型最佳取值时的各参数水平：蒸煮时间为15min、基质含水量为55%、装样量为30g/250mL、发酵温度为35℃、接种量为7%、发酵时间为36h、Mg2+添加量为0.20%，其中接种量与Mg2+添加量的交互效应对产酶活力影响最显著。在此工艺下发酵，纳豆激酶的活力达到6918.76IU/g。 再次通过双菌混合发酵以改善纳豆的口感。先在单因素试验的基础上运用Central Composite Design试验设计法优化接种毛霉菌MS-7纯种发酵产蛋白酶的培养条件，回归模型得出的最佳培养条件为：发酵时间58.62h、发酵温度27.38℃、接种量5.92%、初始pH为5.02，此时蛋白酶活为207.605U/g。在纯种发酵的基础上，通过正交设计优化B. subtilis BN-05和MS-7的混合发酵条件，以NK活力为指标得出最佳的发酵条件为培养温度为30℃，接种量为6%，培养时间为24h，菌种配比为1:1，NK活力为3426.45IU/g，氨基态氮的含量为1.08%，在此发酵条件下产品的氨臭味明显减少，有淡淡的香味物质。 最后为制备富含NK和Monaclin K的新型纳豆食品，达到同时缓解血栓、降低血脂和胆固醇的目的，并改善纳豆的风味，以适合中国人的口味。本试验先以Monacolin K为指标，通过单因素和正交试验确定最佳的发酵参数，即经乳酸浸泡后，基质含水量为40%的发芽大豆，经灭菌冷却后，接种红曲M1和GIM3.439共同发酵，发酵2d后，按1.5%的接种量接种已培养48h的酵母种子液，在27℃的恒温培养箱中培养28天，采用优化的工艺，发酵产品中Monacolin K含量达到1.22mg/g，并对产品的安全性进行评价，利用HPLC检测发酵产品中桔霉素和黄曲霉毒素B1的含量，分别为0.10mg/kg和3.4μg/kg均在限量范围内。其次研究枯草芽孢杆菌BN-05和红曲菌的混合发酵工艺，以Monacolin K和NK活力为指标，通过单因素和正交试验确定混合发酵的最佳发酵工艺参数，即大豆破碎度为1/4去皮、碳源为2.00%、初始含水量为35%、氮源为1.50%，此工艺发酵产品中Monacolin K含量为1.615mg/g，纳豆激酶的活力为3228IU/g，γ-氨基丁酸的含量达到20.11mg/g。同时检测发酵产品中桔霉素以及黄曲霉毒素B1含量，分别为0.08mg/kg和3.7μg/kg均在限量范围内。
【关键词】：纳豆激酶 发酵 响应面分析 蛋白酶活 γ-GABA Monacolin K
【学位授予单位】：武汉轻工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 1 绪论12-19
• 1.1 引言12
• 1.2 发芽大豆营养价值12-13
• 1.3 纳豆激酶的研究进展13-16
• 1.3.1 纳豆激酶的溶栓功效13
• 1.3.2 纳豆激酶的理化特性13-14
• 1.3.3 纳豆激酶基因14
• 1.3.4 纳豆激酶的发酵工艺14-15
• 1.3.5 纳豆激酶产品15-16
• 1.3.6 NK 活性测定研究16
• 1.4 红曲次级代谢产物莫纳可林 K 的研究进展16-18
• 1.4.1 Monacolin K 的研究历史16-17
• 1.4.2 Monacolin K 的理化性质17
• 1.4.3 Monacolin K 功能特性17-18
• 1.5 本论文的研究目的和工作设想18-19
• 2 高产纳豆激酶生产菌株的筛选及鉴定19-33
• 2.1 引言19
• 2.2 试验材料与设备19-21
• 2.2.1 样品和模式菌株19-20
• 2.2.2 试验试剂20
• 2.2.3 试验设备20-21
• 2.2.4 培养基21
• 2.3 试验方法21-24
• 2.3.1 菌株筛选21-22
• 2.3.2 纳豆激酶基因 PCR 筛选法22-23
• 2.3.3 菌种鉴定23-24
• 2.3.4 纤溶活力分析24
• 2.4 结果与分析24-32
• 2.4.1 菌株初筛24-25
• 2.4.2 固体发酵复筛25
• 2.4.3 纤溶活性分析25-27
• 2.4.4 纳豆激酶基因 PCR 筛选法27-28
• 2.4.5 菌株鉴定28-32
• 2.5 本章小结32-33
• 3 产纳豆激酶纯种发酵工艺优化33-45
• 3.1 引言33
• 3.2 试验材料与设备33-34
• 3.2.1 试验菌株33
• 3.2.2 试验试剂33
• 3.2.3 试验设备33
• 3.2.4 培养基33-34
• 3.3 试验方法34-36
• 3.3.1 发芽大豆的制备34
• 3.3.2 种子生长曲线34
• 3.3.3 固态发酵工艺34
• 3.3.4 功能成分分析34
• 3.3.5 试验设计34-35
• 3.3.6 产品营养评价35-36
• 3.4 试验结果与分析36-43
• 3.4.1 发芽大豆的制备工艺36
• 3.4.2 种子生长曲线36-37
• 3.4.3 Plackett-Burman 试验结果及分析37-38
• 3.4.4 响应面中心组合设计结果及分析38-42
• 3.4.5 产品营养评价42-43
• 3.5 本章小结43-45
• 4 双菌混合发酵工艺研究45-57
• 4.1 引言45
• 4.2 试验材料与设备45-47
• 4.2.1 试验菌株45
• 4.2.2 试验试剂45-46
• 4.2.3 试验设备46
• 4.2.4 培养基46-47
• 4.3 试验方法47-48
• 4.3.1 纯种发酵生产发芽大豆豆制品的工艺优化47
• 4.3.2 混合发酵生产发芽大豆豆制品的工艺优化47-48
• 4.3.3 产品成分分析48
• 4.4 结果与分析48-56
• 4.4.1 纯种发酵生产发酵豆制品的单因素分析48-50
• 4.4.2 纯种发酵响应面试验结果分析50-54
• 4.4.3 双菌混合发酵工艺优化54-56
• 4.5 本章小结56-57
• 5 固态发酵发芽大豆产莫纳可林 K 工艺优化57-71
• 5.1 引言57
• 5.2 试验材料与设备57-59
• 5.2.1 试验菌株57
• 5.2.2 试验试剂57-58
• 5.2.3 试验设备58
• 5.2.4 培养基58-59
• 5.3 试验方法59-61
• 5.3.1 发酵工艺设计59
• 5.3.2 产 Monacolin K 的单因素及正交实验设计59-60
• 5.3.3 功能成分分析及安全性评价60-61
• 5.4 结果与分析61-70
• 5.4.1 Monacolin K 标准曲线的绘制及图谱61-62
• 5.4.2 多菌种混合固态发酵产 Monacolin K 的工艺优化62-67
• 5.4.3 产品的功能性及安全性评价67-70
• 5.5 本章小结70-71
• 6 多菌种混合发酵产 MK 和 NK 的工艺优化71-81
• 6.1 引言71
• 6.2 试验材料与设备71-72
• 6.2.1 试验菌株71
• 6.2.2 试验试剂71
• 6.2.3 试验设备71
• 6.2.4 培养基71-72
• 6.3 试验方法72-73
• 6.3.1 产 MK 和 NK 单因素试验设计72
• 6.3.2 产 MK 和 NK 正交试验设计72-73
• 6.3.3 功能成分分析及安全性评价73
• 6.4 结果与分析73-80
• 6.4.1 单因素试验结果与分析73-77
• 6.4.2 正交实验结果与分析77-79
• 6.4.3 产品的安全性评价及分析79-80
• 6.5 本章小结80-81
• 7 结论与展望81-83
• 7.1 主要结论81-82
• 7.2 创新点82
• 7.3 工作展望82-83
• 参考文献83-90
• 致谢90-91
• 附录 A 五株高纤溶活性的菌株 PCR 产物扩增片断的测序结果91-95
• 攻读学位期间的研究成果95

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：330249