不同蛔虫抗原刺激DC差异性对T细胞亚群活性的影响

发布时间：2017-04-27 11:20

  本文关键词：不同蛔虫抗原刺激DC差异性对T细胞亚群活性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 通过用两种蛔虫抗原体外刺激树突状细胞（Dendritic Cell, DC）,检测DC表面分子的差异和与之共同培养的淋巴细胞中细胞因子IL-10、TNF-及Foxp3mRNA表达量变化，以探讨两种蛔虫抗原刺激DC介导T细胞亚群活性及其产生的差异，了解不同蛔虫对宿主寄生特异性的免疫机制。 方法： 1、蛔虫抗原的制备：将人蛔虫、猪蛔虫虫体制成匀浆，经20,000rpm离心30min，去除组织糜沉淀，取上清过0.4μm滤膜除菌，用核酸/蛋白分析仪检测其蛋白浓度，并排除内毒素污染后，分装后置-30℃冻存备用 2、实验分组：实验设计7个组，分别为3个不同浓度的人蛔虫抗原应用液刺激DC组（H1-DC、H2-DC及H3-DC）；3个不同浓度的猪蛔虫抗原应用液刺激DC组（P1-DC、P2-DC及P3-DC）和仅有DC诱导体系（不含任何抗原）空白对照组（K-DC）。人、猪蛔虫抗原的3个梯度浓度都分别为10g/ml、100g/ml和200g/ml。 3、骨髓DC的诱导培养：取C57BL/6小鼠的肱骨、胫骨和股骨，用500U/ml双抗（青霉素和链霉素）PBS浸泡清洗后剪断骺端，用RPMI1640液抽吸将骨髓冲出，将所得细胞过200目钢网成单个细胞，而后用红细胞裂解液处理，洗涤2遍后，用DC诱导体系定容制成细胞悬液，按3×107/孔接入六孔板，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，3天后，，吸弃悬浮细胞，加入同体系培养液4ml/孔。每天半量换液，第6天收集DC（取一份作为流式细胞检测的初始DC来源）。 4、蛔虫抗原刺激DC：将第6天收集悬浮DC细胞,按实验分组分别加入不同浓度蛔虫抗原培养,细胞密度为8×104/ml，48小时后收集悬浮细胞，即为刺激后DC (H1-DC、H2-DC、H3-DC和P1-DC、P2-DC、P3-DC及K-DC)。 5、FCM检测DC表面分子的表达：分别收集初始DC和P1-DC、H1-DC和K-DC,用PBS洗后，用0.3%叠氮钠溶液重悬，各组加入相应量的anti-CD11c PE、anti-CD83FITC、anti-CD80PE-Cy5及anti-CD86PE，混合后4℃避光反应半小时以上，用流式上样缓冲液清洗后上机。 6、脾淋巴细胞分离：用淋巴细胞分离液处理小鼠的脾脏的单细胞悬液，洗涤2遍后用含10%FBS的RPMI1640调整细胞浓度为1×107/ml，接于6孔板（4ml/孔），放入37℃、5%CO2环境中培养4小时，收集悬浮细胞备用。 7、ELISA检测细胞因子：将收集的各组抗原刺激DC及K-DC用25μg/ml丝裂霉素C处理，而后按1:25的数量比混合脾淋巴细胞于培养箱中培养。分别于24h、48h、72h取1板水平离心（2,000r/min、15min）,收集上清，而后对收集的各组上清，用ELISA法检测Th1/Th2细胞因子(TNF-/IL-10)的表达。 8、荧光定量PCR：取中浓度抗原刺激的DC（H2-DC、P2-DC）和K-DC经丝裂霉素C处理后，与脾淋巴细胞细胞按1:25比例混合培养，分别在24h、48h、72h收集细胞，用TRIzol溶解收集，于-30℃保存。按TRIzol一步法抽提总RNA，紫外分光光度法测定RNA的浓度。按Invitrogen的M-MLV第一链合成试剂盒逆转录成cDNA，然后按SYBGreen试剂盒进行定量PCR扩增,以cyclophilin-A作为内参。反应条件为：50℃2min，90℃2min及95℃15s，60℃30s，反应50个循环。每组标本设3个复孔，以K-DC组第1天的表达量为对照，计算Foxp3mRNA的相对表达量RQ值即2-Ct。 9、统计学分析：利用SPSS18.0统计软件，采用one-way ANOVA和UNIANOVA分析，结果用x s表示 结果： 1、FCM法检测DC表面分子的表达：FCM检测四组DC表面CD11c、CD80、CD86及CD83的表达水平，分离所得CD11c表达比例96.93%的DC；两种蛔虫抗原都会影响DC表面活性分子的表达，相对于K-DC，P1-DC组各分子表达量都明显下降，而H1-DC组则有一定程度的升高。 2、ELISA检测Th1/Th2细胞因子表达：除H3-DC外，各时间段实验组TNF-的表达量都低于对照组（K-DC），且都有显著性差异（P0.05）。低浓度组及高浓度组除24h段与72h段外，各时间段，相同浓度的两种抗原刺激组间没有显著差异（P0.05）。而IL-10在各组的表达量随时间延长而增加；各时间段的相同浓度除24h外，人蛔虫抗原组高于猪蛔虫抗原组（P0.05）。 3、荧光定量PCR分析Foxp3mRNA的相对表达水平：相对于H2-DC组Foxp3mRNA的表达量，K-DC和P2-DC组各个时间段都较低，且都与前者存在差异性（P0.05）。H2-DC组的表达量在短期内增加明显，但又随时间而减少。P2-DC组则先增后减，但都与K-DC组间无差异性（P0.05）。 结论： 1、两种蛔虫抗原对DC表面分子表达量的均有刺激作用。但是两者表现不同：猪蛔虫抗原表现为抑制DC表面分子表达，而人蛔虫抗原则促进DC表面分子表达。 2、两种蛔虫抗原刺激的DC均可促进淋巴细胞的Th1/Th2免疫平衡向Th2偏移，但人蛔虫抗原的效果更强。 3、不同蛔虫抗原刺激的DC对Tregs活性的影响是不同的：人蛔虫抗原刺激的DC促进Foxp3mRNA的表达，猪蛔虫抗原刺激的DC不影响Foxp3mRNA的表达。
【关键词】：人蛔虫 猪蛔虫 蛔虫抗原 树突状细胞 T淋巴细胞 Foxp3
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R383;S855.9
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文缩写一览表12-13
• 第1章 引言13-16
• 1.1 人蛔虫和猪蛔虫比较研究现状13-14
• 1.2 蛔虫感染宿主免疫学研究进展14-16
• 第2章 材料与方法16-25
• 2.1 实验动物、试剂与设备16-18
• 2.1.1 实验动物及细胞株16
• 2.1.2 主要的实验试剂16
• 2.1.3 主要的实验设备16-17
• 2.1.4 主要的试剂配制17-18
• 2.2 实验方法18-25
• 2.2.1 蛔虫抗原的制备18
• 2.2.2 实验分组18
• 2.2.3 骨髓 DC 的诱导培养18-19
• 2.2.4 DC 的形态学观察19
• 2.2.5 蛔虫抗原刺激髓源 DC19
• 2.2.6 FCM 检测 DC 表面分子的表达19
• 2.2.7 脾淋巴细胞分离19-20
• 2.2.8 ELISA 法检测细胞因子20-21
• 2.2.9 荧光定量 PCR 分析 Foxp3 mRNA 的相对表达水平21-24
• 2.2.10 统计学分析24-25
• 第3章 结果25-31
• 3.1 蛔虫抗原的制备25
• 3.2 DC 的形态学特征25
• 3.3 FCM 法检测 DC 表面分子的表达25-26
• 3.4 ELISA 检测 Th1/Th2 细胞因子表达26-29
• 3.5 荧光定量 PCR 分析 Foxp3 mRNA 的相对表达水平29-31
• 第4章 讨论31-36
• 4.1 两种蛔虫抗原差异性地调节 DCs 表面分子表达31-32
• 4.2 不同蛔虫抗原对 Th1/Th2 平衡的影响32-34
• 4.3 荧光定量 PCR 分析 Foxp3 mRNA 的相对表达水平34-36
• 第5章 结论36-37
• 致谢37-38
• 参考文献38-42
• 附录42-43
• 攻读学位期间的研究成果43-44
• 综述44-50
• 参考文献48-50

【参考文献】

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本文编号：330537