自制无血清培养体系长期培养对hESCs“干性”维持和notch1表达的影响

发布时间：2017-04-27 15:36

  本文关键词：自制无血清培养体系长期培养对hESCs“干性”维持和notch1表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 观察本实验室自制无血清培养基持续培养扩增hESCs对其“干性”的维持以及Notch1的表达变化趋势，以探讨该培养体系长时间培养扩增hESCs的效果以及Notch信号激活在维持hESCs“干性”中的作用。 方法： 收集自制无血清培养基传代扩增至第20代、30代的hESCs；应用免疫荧光染色法检测两代hESCs特异性标志OCT4、Nanog、SSEA-4的表达；碱性磷酸酶显色法检测两代hESCs碱性磷酸酶活性；体外接种hESCs至免疫缺陷小鼠，观察畸胎瘤形成，并行组织切片观察内、中、外三个胚层形成；应用Real-timePCR、Western-bolt技术，比较Notch1信号分子在两代细胞组分的表达情况，进行统计分析。 结果： （1）免疫荧光染色法结果：两代hESCs细胞均表达OCT4、Nanog、SSEA-4，呈强阳性反应； （2）碱性磷酸酶显色结果示：显微镜下观察两代hESCs细胞均被染成蓝紫色，呈强阳性反应； （3）免疫缺陷小鼠畸胎瘤切片可见：分别注射了两代hESCs的小鼠形成的畸胎瘤切片染色提示均有内胚层、中胚层、外胚层组织的形成。 （4）Real-time PCR技术比较Notch1基因在两代细胞中的表达情况：hESCs的Notch1基因表达第30代是20代的（8.4±0.23）倍，p0.05。 （5）Western-bolt技术比较Notch1蛋白在两代细胞中的表达情况：第30代hESCs的Notch1蛋白300kd片段相对表达量为（0.17±0.013），第20代为（0.016±0.002），，第30代hESCs的Notch1蛋白120kd片段相对表达量为（0.41±0.021），第20代为（0.36±0.018），第30代hESCs的Notch1蛋白总表达水平明显高于第20代hESCs（p0.05）。 结论： （1）自制无血清无饲养层培养基能持续培养hESCs并维持其干性不变； （2）hESCs持续传代后，Notch1信号分子呈较高的表达状态，提示本无血清培养系统中hESCs在体外“干性”的维持可能与Notch信号激活有关，有待进一步研究。
【关键词】：人胚胎干细胞 无血清培养基 无饲养层 Notch
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词对照表9-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料与方法-实验材料12-24
• 2.1 细胞系12
• 2.2 实验动物12
• 2.3 基本材料12
• 2.4 主要实验试剂12-13
• 2.5 主要实验仪器13-14
• 2.6 部分主要试剂配制14-16
• 2.7 hESCs 的培养16-18
• 2.7.1 hESCs 的复苏16-17
• 2.7.2 hESCs 的日常培养和换液17
• 2.7.3 hESCs 的传代17
• 2.7.4 hESCs 的冻存17-18
• 2.8 实验分组及步骤18-23
• 2.8.1 hESCs 干性鉴定18-19
• 2.8.2 Notch1 在两代细胞中的表达情况：19-23
• 2.9 统计学方法23-24
• 第3章 实验结果24-31
• 3.1 显微镜下观察 hESCs 形态学特征24
• 3.2 碱性磷酸酶染色24-25
• 3.3 免疫荧光染色25-27
• 3.4 畸胎瘤组织切片观察27
• 3.5 RNA 纯度及质量27-28
• 3.6 Notch1 基因在各细胞组分的表达情况28-30
• 3.7 Notch1 蛋白在各细胞组分的表达情况：30-31
• 第4章 讨论31-35
• 4.1 自制无血清培养体系中 hESCs 干性维持分析32-34
• 4.2 Notch1 表达变化与体外维持 hESCs 的“干性”潜在相关性分析34-35
• 第5章 结论与展望35-36
• 5.1 小结与结论35
• 5.2 展望35-36
• 致谢36-37
• 参考文献37-40
• 攻读学位期间的研究成果40-41
• 综述41-47
• 参考文献45-47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 喻松霞;郭玲玲;贺文凤;贺玲;李洁;李剑;;人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立[J];基础医学与临床;2013年07期

2 涂怀军;李剑;石庆之;余小骊;李洁;吴琼;;无血清培养条件诱导人脐血间充质干细胞向神经细胞的分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年06期

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4 李剑;涂怀军;石庆芝;李洁;吴琼;戴革;戴育成;;脐血间充质干细胞的无血清培养[J];中华血液学杂志;2006年06期

  本文关键词：自制无血清培养体系长期培养对hESCs“干性”维持和notch1表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：330888