鸟分枝杆菌的分离鉴定及PhoR基因表达和蛋白功能研究

发布时间：2017-04-29 07:08

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【摘要】：研究目的： 非结核分枝杆菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）所感染的疾病在日益流行的AIDS/HIV病患中不断涌现。因其临床表现与结核病极其相似，早期诊断易出现误诊、漏诊。研究开发快速准确的分枝杆菌菌种鉴定技术对NTM病早期诊断与及时治疗具有重要意义。鸟分枝杆菌复合体（Mycobacterium avium complex，MAC）在AIDS/HIV患者NTM病中所占比例甚大。为更好地了解、研究AIDS/HIV患者中的NTM持留存活机制，本实验采用16S rRNA测序法对15例来自AIDS/HIV患者痰培养阳性标本进行鉴定得到鸟分枝杆菌，并初步探究鸟分枝杆菌PhoR基因功能。 实验方法： 1、鸟分枝杆菌的分离鉴定 本实验采用16S rRNA测序法对15例来自AIDS/HIV患者痰培养阳性标本进行鉴定 2、鸟分枝杆菌PhoR基因的原核表达 检索NCBI数据库获得鸟分枝杆菌104菌株PhoR基因序列，在其两侧加入BamH I和EcoR I酶切位点，设计并合成引物后进行PCR扩增；将胶回收的PCR产物与pGEX-4T-3表达载体双酶切处理，T4连接酶连接转化，构建重组质粒pGEX-4T-3-PhoR，PCR与双酶切验证正确后测序。测序结果经拼接比对后进行生物信息学分析，随后pGEX-4T-3-PhoR重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，菌体破碎后进行SDS-PAGE电泳分析。 3、PhoR基因原核表达对重组菌在三种耐受条件下生存影响 大肠杆菌BL21(DE3)和含pGEX-4T-3质粒的大肠杆菌BL21(DE3)分别在SDS、NaNO2及H2O2条件下进行耐受阈值实验，确定各自最大耐受阈值。将IPTG诱导培养2h的重组菌BL/pGEX-4T-3-PhoR和BL/pGEX-4T-3，用LB培养液调整至OD600为0.8后，分别进行大肠杆菌在0.4%SDS、7mmol/L NaNO2及1mmol/L H2O2耐受条件下的生存影响实验。 实验结果： 1、鸟分枝杆菌的分离鉴定 15例分枝杆菌中有9株结核分枝杆菌、4株鸟分枝杆菌、2株脓肿分枝杆菌。测序结果中显示有四条序列完全一样，长度为496bp。NCBIBLAST比对发现，其与鸟分枝杆菌104菌株16S rRNA序列基本一样，只在序列的第81位存在差异，判断其为鸟分枝杆菌。 2、鸟分枝杆菌PhoR基因的原核表达 采用温度梯度PCR法扩增PhoR基因，条带大小约为1500bp，与预计大小基本相符。构建重组表达质粒pGEX-4T-3-PhoR经测序验证后进行原核表达，SDS-PAGE实验结果显示空载对照组，出现清晰的蛋白条带，与预期GST标签蛋白条带(26.8kD)接近。重组质粒实验组表达的融合蛋白大小约为85kD，，比预期蛋白大小77.6kD略微偏大。 3、PhoR基因原核表达对重组菌在三种耐受条件下生存影响 （1）在0.4%SDS耐受条件下，实验组BL/pGEX-4T-3-PhoR与空载对照组BL/pGEX-4T-3细菌生长情况一样，均无法存活。 （2）在7mmol/L NaNO2耐受条件下，实验组BL/pGEX-4T-3-PhoR能够继续生长繁殖，而空载质粒组基本无法存活。 （3）在1mmol/L H2O2耐受条件下，实验组BL/pGEX-4T-3-PhoR仍然可以生长繁殖，而空载质粒组基本无法存活。 结论： （1）成功从15例AIDS/HIV患者痰培养阳性的样本中分离鉴定出一株鸟分枝杆菌104菌株。 （2）成功构建了pGEX-4T-3-PhoR重组表达质粒。 （3）PhoR基因表达对大肠杆菌在SDS最大耐受阈值条件下耐受存活无作用。 （4）PhoR基因表达有助于大肠杆菌在NaNO2和H2O2最大耐受阈值条件下耐受存活。
【关键词】：非结核分枝杆菌 分离鉴定 鸟分枝杆菌 PhoR 肺部表面活性物质 活性氧 活性氮
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.911;Q78
【目录】：

• 英文缩略语表5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-17
• 第一章 鸟分枝杆菌的分离鉴定17-22
• 1 材料与试剂17
• 2 实验方法17-20
• 3 实验结果20-22
• 第二章 鸟分枝杆菌 PhoR 基因的原核表达22-38
• 1 材料与试剂22-24
• 2 实验方法24-30
• 3 实验结果30-38
• 第三章 PhoR 基因原核表达对宿主菌耐受不良环境功能研究38-41
• 1 材料与试剂38
• 2 实验方法38-39
• 3 实验结果39-41
• 讨论41-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 课题综述50-61
• 参考文献58-61
• 致谢61-62
• 攻读学位期间发表的学术论文目录62

【参考文献】

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1 李俊明;朱道银;;结核分支杆菌感染与巨噬细胞的凋亡[J];国际检验医学杂志;2006年01期

2 马s

本文编号：334388