HCMV重组嵌合抗原表达及其诊断初步应用

发布时间：2017-04-29 12:25

  本文关键词：HCMV重组嵌合抗原表达及其诊断初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：选用人巨细胞病毒（HCMV）抗原性强且亲水性高的基因片段构建的三种重组嵌合抗原，诱导、表达、纯化获得目的蛋白；采用ELISA法检测合肥地区孕妇、儿童等血清HCMV的感染情况，并平行比较构建的三种重组嵌合抗原的敏感性和特异性，并分析感染HCMV的孕妇、儿童、肿瘤疾病等相关危险因子。 方法：通过Protean软件分析了的HCMV UL32、UL44、UL55、UL83、UL123序列，通过设计合理引物，各基因片段用Overlap PCR方法连接，并引入Bgl II、BamHI酶切位点，成功构建这三种重组质粒且经诱导表达，重组蛋白用Ni2+NTA亲和层析的方法纯化获得：HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123。采用Western blot法检测免疫反应性。利用这三种重组蛋白作为抗原建立和优化了HCMV血清学检测ELISA方法，检测安徽合肥地区76例孕妇、150例呼吸道疾病儿童和43例肿瘤患者的血清。运用SPSS16.0软件对其结果进行分析处理。 结果：成功构建了HCMV重组嵌合抗原表达质粒，并能够诱导表达于大肠杆菌中，，并且也较高纯度的纯化出了目的蛋白，验证其具有较强的免疫反应性，建立重组抗原ELISA检测方法。与商业试剂盒比较其重组抗原的敏感度、特异性均为100%，而商业试剂盒的特异性为100%,敏感度为97.6%。 ①孕妇血清HCMV IgG阳性率为55.3%，其中，孕周在19~21周的孕妇感染率为75%，Logistic回归分析结果显示：HCMV感染率与孕妇孕周、年龄、AFP（甲胎蛋白）、HCG（人绒毛膜促性腺激素）、游离雌三醇（uE3）水平以及糖尿病均无显著差异性（P＞0.05）。②儿童血清HCMV阳性率为32.7%，Logistic回归分析结果显示：儿童年龄、淋巴细胞百分比水平及呼吸道感染中患MPP（肺炎支原体肺炎）与HCMV感染率之间有显著相关性（P＜0.05）；而性别、WBC（白细胞）、RBC（红细胞）、PLT（血小板）、CPR（C反应蛋白）水平与HCMV感染率之间均无显著相关性（P＞0.05）。呼吸道疾病儿童血清KSHV阳性率为16.7%，Logistic回归分析结果显示：儿童年龄、性别、WBC、RBC、PLT、淋巴细胞百分比及CRP水平与感染率之间均无明显相关性（P＞0.05）。③肿瘤患者HCMV阳性率为20.9%，其感染HCMV阳性的有9例，Logistic回归分析结果显示：年龄、性别、肿瘤均与HCMV感染率无显著相关性（P＞0.05）。④肿瘤患者KSHV阳性率为30.2%，其感染HCMV阳性的有13例，Logistic回归分析结果显示：肿瘤与KSHV感染率有显著相关性（P＜0.05）。 HCMV IgG血清抗体阳性率与KSHV血清抗体阳性率之间比较，150份儿童血清中，HCMV IgG抗体阳性率为32.7%，KSHV抗体阳性率为16.7%，两抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=9.93, P=0.002）。76例孕妇的血清HCMV IgG抗体阳性率为55.3%，KSHV感染阳性率为1.3%，两抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=39.09, P=0.000）。43例肿瘤患者的血清中HCMV感染率为20.9%，KSHV感染率为30.2%，两抗体阳性率差异无统计学意义（χ2=1.125，P=0.289）。 结论：构建了HCMV重组嵌合抗原表达质粒，并成功诱导表达于大肠杆菌中，且也较高纯度的纯化出了目的蛋白，验证其具有较强的免疫反应性，建立重组抗原的检测方法。在血清学检测中HCMV感染率与孕妇的孕周、AFP、HCG及雌激素水平均无相关性；其中肺炎支原体肺炎与HCMV感染率相关，以及在10.01～１2月和淋巴细胞比例大于40.01%均与HCMV感染率有显着相关性；提示HCMV感染与呼吸道感染之间有密切关系，认为可能是由于儿童HCMV活动期感染导致肺功能下降，免疫力低下诱发支原体肺炎的发生，诱使呼吸道感染反复发作；也可能是儿童MPP感染使免疫功能改变，增加其它病原菌对机体的侵袭。
【关键词】：人巨细胞病毒 卡波氏肉瘤相关疱疹病毒 血清感染 肺炎支原体肺炎
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 英文缩略词表6-8
• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 前言13-15
• 2 材料与方法15-25
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 质粒和菌株15-16
• 2.1.2 血清样本16
• 2.1.3 试剂16
• 2.1.4 仪器和设备16-17
• 2.2 方法17-25
• 2.2.1 溶液的配制17-21
• 2.2.2 感受态 BL21(DE3)的制备21
• 2.2.3 重组质粒的转化21-22
• 2.2.4 目的蛋白诱导表达22
• 2.2.5 目的蛋白 SDS-PAGE 电泳及考马斯染色和脱色22
• 2.2.6 Ni-NTA 纯化目的蛋白22-23
• 2.2.7 纯化样品 SDS-PAGE 电泳与浓度检测23
• 2.2.8 重组蛋白经 Western blot 检测其免疫反应23
• 2.2.9 H C M V 感染孕妇和儿童血清的 E L I S A 法检测及条件优化23-24
• 2.2.10 HCMV 重组嵌合抗原血清学检测24
• 2.2.11 孕妇、儿童及肿瘤患者血清学 HCMV 与 KSHV 感染率比较24
• 2.2.12 统计学分析24-25
• 3 结果25-45
• 3.1 各融合基因片段的 PCR 鉴定25-26
• 3.2 HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123 重组质粒的鉴定26-31
• 3.3 HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123 的表达与纯化31-33
• 3.4 HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123 免疫反应性分析33-34
• 3.5 诊断的初步应用以 HCMV pQE80-L-UL32-UL44-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83、pQE80-L-UL32-UL44-UL-55-UL83-UL123 蛋白为抗原的 ELISA 体系建立与优化34-35
• 3.6 安徽地区 HCMV 孕妇及儿童等血清学检测结果35-45
• 3.6.1 合肥地区 HCMV 孕妇血清学敏感性、特异性检测结果35-36
• 3.6.2 合肥地区孕妇 HCMV 血清检测结果36-38
• 3.6.3 合肥地区儿童 HCMV 血清学检测结果38-40
• 3.6.4 合肥地区儿童 KSHV 血清学检测结果40-42
• 3.6.5 合肥地区肿瘤患者 HCMV 血清检测结果42-43
• 3.6.6 合肥地区肿瘤患者 KSHV 血清检测结果43
• 3.6.7 HCMV 血清阳性率与 KSHV 血清阳性率之间比较43-45
• 4 讨论45-50
• 5 结论50-52
• 5.1 HCMV 重组嵌合抗原的构建与表达50-51
• 5.2 诊断应用重组嵌合抗原作为包被抗原检测合肥地区孕妇、支原体肺炎儿童血清 HCMV 感染率51-52
• 参考文献52-58
• 附录58-59
• 致谢59-60
• 综述 HCMV 相关基因在母婴共感染、移植及其它疾病中的研究与进展60-68
• 参考文献65-68

【参考文献】

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本文编号：334877