RIP3功能启动子的鉴定及其调控研究
发布时间:2017-05-02 11:10
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【摘要】:研究背景和目的:受体相互作用蛋白激酶3(Receptor-Interacting ProteinKinase-3, RIPK3or RIP3)参与肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)或Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)介导的细胞坏死信号通路,有文章报道RIP3在细胞凋亡中也起到调控作用。研究表明,RIP3介导的细胞坏死在胰腺炎等疾病中发挥重要作用。因此,对于RIP3表达调控机理研究具有十分重要的意义,但是至今为止关于RIP3的调控机理研究尚未报道。因此,本课题旨在研究RIP3转录调控机制,鉴定核心启动子区域并对其调控机制做进一步研究。 研究方法: (1)通过检测细胞活力检测不同结肠癌细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死敏感性; (2)利用蛋白免疫印迹检测不同结肠癌细胞系中RIP3的表达水平; (3)利用荧光素酶双报告基因系统对RIP3启动子区域进行活性分析; (4)利用过表达系统在293T细胞中验证转录因子Sp1蛋白对RIP3启动子活性的影响; (5)利用RNAi技术在293T细胞中验证转录因子Sp1蛋白对RIP3启动子活性的影响; (6)利用EMSA实验验证Sp1与RIP3启动子区域的相互作用; (7)通过检测细胞活力检测稳定表达Sp1-shRNA的HT-29细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死的敏感性; (8)利用BSP方法检测RIP3启动子区域的甲基化水平。 研究结果: (1)不同结肠癌细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死的敏感性不同。诱导不同结肠癌细胞系发生TNF-α诱导的细胞坏死,通过检测细胞活力发现不同细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死的敏感性不同。 (2)不同结肠癌细胞中RIP3的表达水平有差异。通过蛋白免疫印迹实验发现对TNF-α诱导的细胞坏死敏感性与结肠癌细胞中RIP3的表达水平呈正相关。 (3)RIP3启动子关键区域集中在5’非翻译区(5’-non-translated region,5’UTR)区域以及5’UTR上游19个碱基片段。通过构建含有RIP3启动子区域不同长度片段的重组质粒,在293T细胞中进行荧光素双报告基因系统的检测发现RIP3启动子活性关键区域包含RIP3基因的5’UTR以及5’UTR上游19个碱基片段。 (4)转录因子Sp1结合位点对RIP3启动子活性起到关键调控作用。通过对包含RIP3基因的5’UTR以及5’UTR上游19个碱基片段序列分析,发现该段序列含有三个Sp1结合位点,,通过对这三个Sp1结合位点进行突变,发现第二个Sp1结合位点对RIP3启动子活性调控起到关键作用。 (5)Sp1调控RIP3启动子活性。在293T细胞中过表达Sp1可以促进RIP3启动子活性,转染针对Sp1的siRNA降低Sp1的表达后,RIP3基因的转录活性降低。 (6)Sp1结合到RIP3启动子区域。EMSA以及CHIP实验显示Sp1与RIP3的启动子区域相互结合,而且这种结合可以被Sp1抗体竞争性抑制; (7)低表达Sp1的HT-29细胞对TNF-α诱导的细胞坏死敏感性降低。实验发现表达Sp1-shRNA的HT-29细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死敏感性降低。 (8)在不表达RIP3的结肠癌细胞HCT-116中,反式作用因子Sp1结合位点发生甲基化,抑制RIP3的转录。对RIP3启动子区域进行亚硫酸氢盐修饰后,然后进行测序发现在不表达RIP3的结肠癌细胞HCT-116中,RIP3启动子区域高度甲基化。 结论: 我们首次报道了RIP3的转录调控机理,发现Sp1在结肠癌细胞中调控RIP3基因的转录进而影响其对TNF-α诱导的细胞坏死的敏感性。在一些不表达RIP3的结肠癌细胞系中,RIP3启动子区域发生甲基化,从而抑制了RIP3基因的表达。本实验结果提示在临床治疗相关疾病中,可以通过靶向RIP3启动子区域的Sp1结合位点或甲基化位点,研发特异性药物调控RIP3的表达,进而缓解疾病症状并达到治疗效果。
【关键词】:受体相互作用蛋白激酶3 转录活性 启动子 甲基化
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R3411
【目录】:
- 中文摘要4-7
- Abstract7-11
- 前言11-13
- 材料与方法13-29
- 1. 实验材料13-19
- 2. 实验方法19-29
- 实验结果29-38
- 1. 结肠癌细胞对 TNF-α诱导的细胞坏死敏感性与细胞中 RIP3 的表达呈正相关29-30
- 2. 5'UTR 区域 Sp1 结合区域调控 RIP3 启动子活性30-32
- 3. RIP3 启动子区域的 Sp1 结合位点调控 RIP3 启动子活性32-34
- 4. Sp1 结合至 RIP3 启动子区域34-35
- 5. 低表达 Sp1 的 HT-29 细胞系对 TNF-α诱导的细胞坏死敏感性降低35-36
- 6. 启动子区域的甲基化调控 RIP3 的表达36-38
- 总结38-39
- 结论与讨论39-40
- 参考文献40-42
- 综述42-55
- 参考文献50-55
- 攻读学位期间本人出版和公开发表的论著、论文55-56
- 致谢56-58
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