华支睾吸虫NOSIP基因的克隆表达及免疫学鉴定
发布时间：2021-10-08 08:25
目的对华支睾吸虫一氧化氮合酶相互作用蛋白（CsNOSIP）进行克隆和原核表达,初步了解其重组产物的免疫学功能。方法从华支睾吸虫基因文库中获得CsNOSIP的全长cDNA并克隆至原核表达质粒pET-30a（+）中,诱导表达后用亲和层析柱进行纯化,用纯化的rCsNOSIP及rCsNOSIP蛋白免疫BALB/c小鼠以获得rCsNOSIP免疫血清,采用Western blot鉴定重组蛋白CsNOSIP的表达及其反应原性;采用ELISA检测rCsNOSIP免疫小鼠血清特异性抗体亚类水平。结果 CsNOSIP基因的开放阅读框（ORF）包含867 bp,编码288个氨基酸,PCR、双酶切及DNA测序表明pET-30a（+）-CsNOSIP重组质粒构建成功。SDS-PAGE检测目的蛋白在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,表达产物相对分子质量为35×103;经亲和层析法获得高纯度的重组蛋白,该蛋白可被His单抗、CsNOSIP免疫小鼠血清、感染华支睾吸虫小鼠血清及ESP免疫血清识别,重组蛋白免疫血清能识别CsESP;ELISA检测显示rCsNOSIP免疫小鼠血清特异抗体滴度...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(07)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
图１重组质粒ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）的双酶切鉴定ＬａｎｅＭ１ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００Ｌａｎｅ１ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｍ－Ｍ１、１、２、３、Ｍ２分别为ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００、ＰＣＲ产物、重组质粒双酶切、ｐＥＴ－３０ａ（＋）
件（温度３０℃，ＩＰＴＧ浓度为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ诱导３ｈ）进行大量诱导表达，对重组蛋白进行纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示纯化蛋白分子量约为３５×１０３条带（图２），同时证明融合蛋白主要以可溶性形式表达。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测得纯化产物的蛋白浓度为１．２５ｍｇ／ｍｌ。Ｍ、１、２、３、４、５、６、７分别为蛋白质标准分子量、空质粒诱导前、诱导后，重组质粒诱导前、诱导后，上清，沉淀和纯化的蛋白图２ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）转染大肠埃希菌ＢＬ２１／ＤＥ３表达的重组蛋白及其纯化产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒＬａｎｅ１ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ２ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ３ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ４ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ５ＳｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ６ＩｎｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ７ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓ
１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后转膜，分别以ａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰ血清和ａｎｔｉ－ｒＣｓ－ＮＯＳＩＰ血清为一抗进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，结果见图５。重组蛋白免疫血清能识别ＣｓＥＳＰ，抗ＥＳＰ免疫血清也能识别重组蛋白，而ＣｓＥＳＰ、ｒＣｓＮＯＳＩＰ不与免疫前小鼠血清反应。１、３为ＣｓＥＳＰ、ＣｓＮＯＳＩＰ与阴性小鼠血清识别２、４分别为ＣｓＥＳＰ与重组蛋白免疫小鼠血清识别；ＣｓＮＯＳＩＰ与ＣｓＥＳＰ蛋白免疫小鼠血清识别图５ＣｓＮＯＳＩＰ中ＣｓＥＳＰ成分的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定Ｌａｎｅ１Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈｐｒｅ－ｉｍｍｕｎｅｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ２Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＮＯＳＩＰｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ３ｒＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰｓｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＦｉｇ．５ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｓＮＯＳＩＰａｓａｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆＣｓＥＳＰｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ８ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗体水平及亚型检测采用ＥＬＩＳＡ检测ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗体滴度为１∶２５６００，ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ的水平均与对照组比较显著升高，且ＩｇＧ１水平高于ＩｇＧ２ａ（ｔ＝１５．１９，Ｐ＜０．０５）（图６）。讨论华支睾吸虫成虫寄生在人体肝脏胆管内，可引起胆管上皮细胞脱落、增生，局限性扩张，胆管上皮细胞有不同程度的腺瘤样增生及结缔组织增生，诱发胆
【参考文献】：
期刊论文
[1]华支睾吸虫感染FVB小鼠不同组织CD4+T细胞TLR4表达变化[J]. 李向阳,颜超,杜莹,于倩,华慧,汤仁仙,郑葵阳. 中国病原生物学杂志. 2018(05)
[2]内皮型一氧化氮合酶在动脉粥样硬化中的作用[J]. 徐启华,曹济民. 医学研究杂志. 2010(08)
本文编号：3423793
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(07)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
图１重组质粒ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）的双酶切鉴定ＬａｎｅＭ１ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００Ｌａｎｅ１ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔａｍ－Ｍ１、１、２、３、Ｍ２分别为ＤＮＡｍａｒｋｅｒＤＬ２０００、ＰＣＲ产物、重组质粒双酶切、ｐＥＴ－３０ａ（＋）
件（温度３０℃，ＩＰＴＧ浓度为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ诱导３ｈ）进行大量诱导表达，对重组蛋白进行纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示纯化蛋白分子量约为３５×１０３条带（图２），同时证明融合蛋白主要以可溶性形式表达。用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测得纯化产物的蛋白浓度为１．２５ｍｇ／ｍｌ。Ｍ、１、２、３、４、５、６、７分别为蛋白质标准分子量、空质粒诱导前、诱导后，重组质粒诱导前、诱导后，上清，沉淀和纯化的蛋白图２ＣｓＮＯＳＩＰ－ｐＥＴ－３０ａ（＋）转染大肠埃希菌ＢＬ２１／ＤＥ３表达的重组蛋白及其纯化产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒＬａｎｅ１ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ２ｐＥＴ－３０ａ（＋）ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ３ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈｏｕｔＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ４ｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｗｉｔｈＩＰＴＧｉｎｄｕｃｔｉｏｎＬａｎｅ５ＳｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ６ＩｎｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｐＥＴ－３０ａ（＋）－ＣｓＮＯＳＩＰｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓＬａｎｅ７ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓ
１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后转膜，分别以ａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰ血清和ａｎｔｉ－ｒＣｓ－ＮＯＳＩＰ血清为一抗进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，结果见图５。重组蛋白免疫血清能识别ＣｓＥＳＰ，抗ＥＳＰ免疫血清也能识别重组蛋白，而ＣｓＥＳＰ、ｒＣｓＮＯＳＩＰ不与免疫前小鼠血清反应。１、３为ＣｓＥＳＰ、ＣｓＮＯＳＩＰ与阴性小鼠血清识别２、４分别为ＣｓＥＳＰ与重组蛋白免疫小鼠血清识别；ＣｓＮＯＳＩＰ与ＣｓＥＳＰ蛋白免疫小鼠血清识别图５ＣｓＮＯＳＩＰ中ＣｓＥＳＰ成分的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定Ｌａｎｅ１Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈｐｒｅ－ｉｍｍｕｎｅｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ２Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓＥＳＰｓｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＮＯＳＩＰｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＬａｎｅ３ｒＣｓＮＯＳＩＰｐｒｏｔｅｉｎｒｅａｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ－ＣｓＥＳＰｓｍｏｕｓｅｓｅｒｕｍＦｉｇ．５ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｓＮＯＳＩＰａｓａｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆＣｓＥＳＰｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ８ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗体水平及亚型检测采用ＥＬＩＳＡ检测ｒＣｓＮＯＳＩＰ免疫小鼠血清抗体滴度为１∶２５６００，ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ的水平均与对照组比较显著升高，且ＩｇＧ１水平高于ＩｇＧ２ａ（ｔ＝１５．１９，Ｐ＜０．０５）（图６）。讨论华支睾吸虫成虫寄生在人体肝脏胆管内，可引起胆管上皮细胞脱落、增生，局限性扩张，胆管上皮细胞有不同程度的腺瘤样增生及结缔组织增生，诱发胆
【参考文献】：
期刊论文
[1]华支睾吸虫感染FVB小鼠不同组织CD4+T细胞TLR4表达变化[J]. 李向阳,颜超,杜莹,于倩,华慧,汤仁仙,郑葵阳. 中国病原生物学杂志. 2018(05)
[2]内皮型一氧化氮合酶在动脉粥样硬化中的作用[J]. 徐启华,曹济民. 医学研究杂志. 2010(08)
本文编号：3423793
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