基于重组MS2病毒样颗粒的前列腺癌RNA疫苗的研究

发布时间：2021-10-09 00:54

　　近年来,RNA疫苗在肿瘤预防及治疗领域的价值愈加重要,不仅因为其具有良好的诱导体液和细胞免疫应答的能力,而且因为其具有DNA疫苗、蛋白疫苗以及多肽疫苗无可比拟的优势：与DNA疫苗相比,RNA疫苗不存在整合到宿主基因组内的可能,安全性较高；与蛋白疫苗相比,RNA疫苗可以诱导较强的细胞免疫应答；与多肽疫苗相比,RNA疫苗的免疫原性更强。然而,RNA的稳定性限制了其作为疫苗在疾病预防及治疗中的应用。尽管现在有多种方式被应用于提高RNA的稳定性,如对RNA骨架进行修饰,脂质体或金粒子包裹等,但是这些方法没有从根本上解决RNA稳定性差的问题,且需要经过体外转录过程或合成途径才能获得大量的RNA,这种制备过程不仅对生产条件要求较高,而且成本较高。腺病毒载体及复制子RNA也是目前常用的RNA递送载体,但病毒载体自身的结构蛋白多样并且其有重组成新病毒的可能,这使其难以应用于临床。目前临床研究及应用中最有效的传递方式是以树突状细胞为靶标的RNA疫苗,但是体外树突状细胞的制备成本较高、操作繁琐,而且自体树突状细胞的来源也有限。此外,microRNA研究及临床应用中还存在细胞内传递效率低的问题。鉴于上述RN... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：176 页

【学位级别】：博士

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英文缩略词
中文摘要
Abstract
第一部分 基于MS2 VLPs的前列腺癌预防及治疗性mRNA疫苗的研究
    前言
    1. 材料与方法
        1.1. 材料
            1.1.1. 菌株、细胞系和质粒
            1.1.2. 主要试剂
            1.1.3. 溶液的配制
            1.1.4. 仪器及耗材
        1.2. 方法
            1.2.1. pMS2-hPAP-GM-CSF、pMS2-mPAP-GM-CSF等酵母表达载体的构建
            1.2.2. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的表达及纯化
            1.2.3. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的鉴定
            1.2.4. CCK法检测细胞毒性
            1.2.5. hPAP-GM-CSF VLPs免疫刺激活性的检测
            1.2.6. VLPs包裹的mRNA体外翻译能力及清除速率的分析
            1.2.7. mRNA疫苗接种
            1.2.8. ELISA法检测抗体效价
            1.2.9. T细胞增殖实验
            1.2.10. ELISA法和ELISPOT法检测细胞因子
            1.2.11. FACS法检测树突状细胞(DCs)和调节性T细胞(Tregs)
            1.2.12. 肿瘤接种及肿瘤大小检测
            1.2.13. 统计学分析
    2. 结果
        2.1. pMS2-hPAP-GM-CSF、pMS2-mPAP-GM-CSF等酵母表达载体的构建
        2.2. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的表达及纯化
        2.3. hPAP-GM-CSF VLPs、mPAP-GM-CSF VLPs等的鉴定
        2.4. VLPs包裹的mRNA体外翻译能力及清除速率的分析
        2.5. hPAP-GM-CSF VLPs的细胞毒性及免疫刺激能力的分析
        2.6. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗对DCs的激活作用
        2.7. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗诱导的体液免疫应答
        2.8. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答
        2.9. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗对调节性T细胞的影响
        2.10. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗肿瘤预防效果的评估
        2.11. hPAP-GM-CSF VLPs等mRNA疫苗肿瘤治疗效果的评估
    3. 讨论
    参考文献
第二部分 基于MS2 VLPs的前列腺癌治疗性microRNA疫苗的初步研究
    前言
    1. 材料与方法
        1.1. 材料
            1.1.1. 菌株、细胞系和质粒
            1.1.2. 主要试剂
            1.1.3. 溶液的配制
            1.1.4. 仪器及耗材
        1.2. 方法
            1.2.1. p2MS2-microRNA-23a、p2MS2-microRNA-23b等酵母表达载体的构建
            1.2.2. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的表达及纯化
            1.2.3. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs的鉴定
            1.2.4. CCK法检测细胞毒性
            1.2.5. TAT-mRNA VLPs及TAT-microRNA VLPs体外翻译能力的分析
            1.2.6. FACS法检测肿瘤细胞凋亡
            1.2.7. 统计学分析
    2. 结果
        2.1. p2MS2-microRNA-23a、p2MS2-microRNA-23b等酵母表达载体的构建
        2.2. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的表达及纯化
        2.3. TAT-microRNA-23a VLPs、TAT-microRNA-23b VLPs等的鉴定
        2.4. TAT-microRNA-23a VLPs的细胞毒性分析
        2.5. 携带TAT的VLPs包裹的RNA体外翻译能力的分析
        2.6. TAT-microRNA-23a VLPs体外抗肿瘤效果的评价
    3. 讨论
    参考文献
论文综述
    参考文献
附录1 pESC-URA载体信息
附录2 pGEM~(?)-T Easy载体信息
附录3 重组表达载体pMS2测序和序列比对结果
附录4 重组表达载体pMS2p测序和序列比对结果
附录5 重组表达载体pMS2-hPAP测序和序列比对结果
附录6 重组表达载体pMS2-mPAP测序和序列比对结果
附录7 重组表达载体pMS2-GM-CSF测序和序列比对结果
附录8 重组表达载体pMS2-hPAP-GM-CSF测序和序列比对结果
附录9 重组表达载体pMS2-mPAP-GM-CSF测序和序列比对结果
附录10 重组表达载体p2MS2测序和序列比对结果
附录11 重组表达载体p2MS2-GM-CSF测序和序列比对结果
附录12 重组表达载体p2MS2-GFP测序和序列比对结果
附录13 重组表达载体p2MS2-microRNA-23a测序和序列比对结果
附录14 重组表达载体p2MS2-microRNA-23b测序和序列比对结果
附录15 重组表达载体p2MS2-microRNA-con测序和序列比对结果
致谢
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本文编号：3425316