通用H5N1亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备
发布时间：2021-10-21 23:55
目的高致病性H5N1亚型流感病毒可感染人,并不断衍生出多个新的基因谱系,存在着大规模流行的可能性。我国现有的商品化疫苗无法对不同谱系的H5N1流感病毒感染提供有效的保护。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）疫苗具有良好的免疫原性和安全性,成为近年研究的热点。本研究旨在建立H5亚型禽流感病毒通用型病毒样颗粒疫苗的制备方法。方法将优化的H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012（clade 2.3.2.1）亚型流感病毒的HLHA（HA stem）/5M2e（5个M2e）/HL5M2e（5M2e替代HA的头部嵌入HLHA）、NP基因和M1基因分别插入pFastBacDual载体,得到相应的重组供体。然后将重组供体转化至含Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,获得含有目的基因的重组杆粒。结果酶切和PCR鉴定表明成功构建了含目的基因的重组杆粒Bacmid-（HLHA/5M2e/HL5M2e、NP、M1）。将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,IFA试验和Western blot试验皆证实,优化的HLHA（HA stem）/5M2e/HL5M2e、N...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(07)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
图２ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ重组质粒双酶切鉴定Ａ１、２ＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２ＨＬＨＡ（１０２３ｂｐ）
、９ｐＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２５Ｍ２ｅ１０ｐＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２Ｍ１Ｆｉｇ．３ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｍｉｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ４重组杆粒转染细胞病变情况将拯救出的重组杆状病毒传至第２代时，正常细胞（图４Ａ）即出现明显病变。Ｓｆ９细胞在接毒１２ｈ后，单个细胞开始变大变圆，细胞内部有颗粒状的病变物质产生（图４Ｂ）。待细胞培养至９６ｈ，细胞悬浮很严重，几乎全部脱落（图４Ｃ）。图４Ｓｆ９细胞病变过程Ｆｉｇ．４Ｓｆ９ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｐｒｏｃｅｓｓ５间接免疫荧光试验检测到目的蛋白的表达间接免疫荧光试验显示，空杆状病毒转染Ｓｆ９细胞（图５Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）为阴性，重组杆状病毒ｒｐＦａｓｔ－Ｂａｃ－２ＨＬＨＡ（图５Ａ）、ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２５Ｍ２ｅ（图５Ｃ）、ｒｐ－ＦａｓｔＢａｃ－２ＨＬ５Ｍ２ｅ（图５Ｅ）、ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２ＮＰ（图５Ｇ）和ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２Ｍ１（图５Ｉ）转染Ｓｆ９细胞均出现绿色荧光，表明重组杆状病毒表达目的蛋白ＨＬＨＡ、５Ｍ２ｅ、ＨＬ５Ｍ２ｅ、ＮＰ和Ｍ１。·５７８·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年７月第１４卷第７期Ｊｕｌ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７
图５目的蛋白间接免疫荧光检测Ｆｉｇ．５Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测目的蛋白的表达分别用抗Ｈ５Ｎ１Ａ／ｍｅｅｒｋａｔ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／ＳＨ－１／２０１２（ＳＨ－１）鸡血清，抗ＮＰ蛋白鼠单克隆抗体，及抗Ｍ１蛋白兔多克隆抗体为一抗对ＡＩＶＶＬＰｓ进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定分析，结果见图６，目的蛋白均被相应抗体识别，表明ＡＩＶ的结构蛋白成功组装了ＡＩＶＶＬＰｓ。图６Ｈ５Ｎ１ＶＬＰｓ的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定Ｆｉｇ．６ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙｓｏｆＨ５Ｎ１ＶＬＰｓ７透射电子显微镜观察ＶＬＰｓ形态将纯化的３种ＡＩＶＶＬＰｓ在透射电镜下观察，可观察到球形结构和１００ｎｍ左右与天然流感病毒形态相近的ＡＩＶＶＬＰｓ（图７）。图７病毒样颗粒形态（４０００×）Ｆｉｇ．７Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（４０００×）讨论自２００３年起，高致病性Ｈ５Ｎ１亚型流感病毒感染人的事件不断发生，并且不断衍生出多个新的基因谱系，存在大规模流行的可能性，因此亟待研制出一种安全有效的能够保护Ｈ５Ｎ１亚型流感病毒不同谱系的通用型疫苗［１２－１３］。病毒样颗粒疫苗作为一种新兴的疫苗，具有良好的安全性和免疫原性［１４］。在有囊膜和无囊膜的情况下，病毒样颗粒均能刺激机体产生体液和细胞免疫反应。用昆虫细胞生产流感疫苗可弥补依赖鸡胚生产流感疫苗的很多缺陷，具有可观的开发与应用前
【参考文献】：
期刊论文
[1]H9N2禽流感病毒血凝素蛋白的主要特性及B/T细胞抗原表位预测分析[J]. 于娟,李红,饶华祥,卢囡囡,雷有菊,赵生仓. 中国病原生物学杂志. 2018(01)
本文编号：3449968
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(07)北大核心CSCD
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
图２ｐＦａｓｔＢａｃｄｕａｌ重组质粒双酶切鉴定Ａ１、２ＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２ＨＬＨＡ（１０２３ｂｐ）
、９ｐＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２５Ｍ２ｅ１０ｐＦａｓｔＢａｃ－Ｄｕａｌ－２Ｍ１Ｆｉｇ．３ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｍｉｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ４重组杆粒转染细胞病变情况将拯救出的重组杆状病毒传至第２代时，正常细胞（图４Ａ）即出现明显病变。Ｓｆ９细胞在接毒１２ｈ后，单个细胞开始变大变圆，细胞内部有颗粒状的病变物质产生（图４Ｂ）。待细胞培养至９６ｈ，细胞悬浮很严重，几乎全部脱落（图４Ｃ）。图４Ｓｆ９细胞病变过程Ｆｉｇ．４Ｓｆ９ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｐｒｏｃｅｓｓ５间接免疫荧光试验检测到目的蛋白的表达间接免疫荧光试验显示，空杆状病毒转染Ｓｆ９细胞（图５Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）为阴性，重组杆状病毒ｒｐＦａｓｔ－Ｂａｃ－２ＨＬＨＡ（图５Ａ）、ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２５Ｍ２ｅ（图５Ｃ）、ｒｐ－ＦａｓｔＢａｃ－２ＨＬ５Ｍ２ｅ（图５Ｅ）、ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２ＮＰ（图５Ｇ）和ｒｐＦａｓｔＢａｃ－２Ｍ１（图５Ｉ）转染Ｓｆ９细胞均出现绿色荧光，表明重组杆状病毒表达目的蛋白ＨＬＨＡ、５Ｍ２ｅ、ＨＬ５Ｍ２ｅ、ＮＰ和Ｍ１。·５７８·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年７月第１４卷第７期Ｊｕｌ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７
图５目的蛋白间接免疫荧光检测Ｆｉｇ．５Ｉｎｄｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测目的蛋白的表达分别用抗Ｈ５Ｎ１Ａ／ｍｅｅｒｋａｔ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／ＳＨ－１／２０１２（ＳＨ－１）鸡血清，抗ＮＰ蛋白鼠单克隆抗体，及抗Ｍ１蛋白兔多克隆抗体为一抗对ＡＩＶＶＬＰｓ进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定分析，结果见图６，目的蛋白均被相应抗体识别，表明ＡＩＶ的结构蛋白成功组装了ＡＩＶＶＬＰｓ。图６Ｈ５Ｎ１ＶＬＰｓ的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定Ｆｉｇ．６ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙｓｏｆＨ５Ｎ１ＶＬＰｓ７透射电子显微镜观察ＶＬＰｓ形态将纯化的３种ＡＩＶＶＬＰｓ在透射电镜下观察，可观察到球形结构和１００ｎｍ左右与天然流感病毒形态相近的ＡＩＶＶＬＰｓ（图７）。图７病毒样颗粒形态（４０００×）Ｆｉｇ．７Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（４０００×）讨论自２００３年起，高致病性Ｈ５Ｎ１亚型流感病毒感染人的事件不断发生，并且不断衍生出多个新的基因谱系，存在大规模流行的可能性，因此亟待研制出一种安全有效的能够保护Ｈ５Ｎ１亚型流感病毒不同谱系的通用型疫苗［１２－１３］。病毒样颗粒疫苗作为一种新兴的疫苗，具有良好的安全性和免疫原性［１４］。在有囊膜和无囊膜的情况下，病毒样颗粒均能刺激机体产生体液和细胞免疫反应。用昆虫细胞生产流感疫苗可弥补依赖鸡胚生产流感疫苗的很多缺陷，具有可观的开发与应用前
【参考文献】：
期刊论文
[1]H9N2禽流感病毒血凝素蛋白的主要特性及B/T细胞抗原表位预测分析[J]. 于娟,李红,饶华祥,卢囡囡,雷有菊,赵生仓. 中国病原生物学杂志. 2018(01)
本文编号：3449968
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